《Cells》：Making Mobile Leaflets: Biomechanical Forces in Atrioventricular Valve Formation
Anji Yang and
Renee Wei-Yan Chow
编辑推荐：
这篇综述系统比较了小鼠、鸡和斑马鱼模型中的房室瓣（AV）形成过程，重点阐述了血流与心脏收缩产生的生物力学力如何通过KLF、NOTCH、NFAT等通路调控瓣膜发育，为理解先天性心脏病（如二尖瓣狭窄、Ebstein畸形）的发病机制提供了多模型视角。
引言
成人心脏每天搏动约十万次，每次心跳中，房室瓣（AV瓣）的启闭确保了血液在心腔间的单向流动。其发育是一个复杂的多步骤过程，包括心内膜垫形成、瓣膜祖细胞增殖、瓣膜窦形成、瓣膜伸长和细胞外基质（ECM）重塑。发育过程中的错误可导致先天性房室瓣疾病，例如二尖瓣狭窄、三尖瓣闭锁和Ebstein畸形，在活产儿中总体发生率约为万分之四。越来越多的证据表明，生物力学信号在整个发育过程中都不可或缺。人类胚胎在孕7周时若心率过慢，患先天性心脏缺陷的风险更高，这提示异常的生物力学力可能扮演重要角色。
成人房室瓣
小鼠和鸡是研究心脏发育的经典模型，它们与人类一样拥有四腔室心脏。在人类，三尖瓣位于右侧，由三个瓣叶组成；二尖瓣位于左侧，由两个瓣叶组成。小鼠与人类的区别在于其右房室瓣由两个瓣叶构成。鸡的左房室瓣有三个瓣叶，而右房室瓣则由单个肌肉瓣构成。斑马鱼作为一种较新的模型，拥有两腔室心脏，其房室瓣是四叶的，包括两个主要瓣叶和两个次要瓣叶。在细胞水平上，房室瓣由瓣膜间质细胞（VICs）和被单层瓣膜内皮细胞包裹的ECM成分组成。人类房室瓣的ECM明显分为三层：富含胶原的纤维层、富含蛋白聚糖的海绵层和富含弹性蛋白的心室层。小鼠和鸡的房室瓣具有类似的三层微结构，但不如人类明显。相比之下，斑马鱼的房室瓣中尚未观察到明显的ECM分层。
瓣膜形态发生
心内膜垫的形成
房室瓣的形成始于原始心管环化后不久。在小鼠和鸡中，房室瓣发育始于房室管上下边缘形成一对ECM膨大物，称为心内膜垫。底层心肌分泌的骨形态发生蛋白（BMP）激活房室内皮，使一部分内皮细胞经历内皮-间质转化（EndoMT）。新形成的间充质细胞进一步增殖，促进心垫生长。在斑马鱼中，上下心垫的形成大约发生在受精后36小时。其ECM膨大远不如小鼠和鸡的明显。大约在50 hpf，覆盖上心垫的一部分内皮细胞经历部分EndoMT，这些细胞集体迁移入ECM并形成双层结构。
从心垫到瓣叶的形态转变
房室瓣发育的下一阶段涉及瓣膜窦形成以及细胞化的心内膜垫向可自由活动的瓣叶转变。对小鼠和鸡的研究表明，羊膜动物的左间隔瓣叶主要通过主要由细胞增殖驱动的心内膜垫伸长形成，而其他瓣叶则通过分层（delamination）形成。分层在心脏瓣膜生物学中根据不同语境有不同的含义：在早期瓣膜发育中，指单个内皮细胞离开内皮层迁移入细胞外基质；在瓣叶形成阶段，指组织水平的过程，即一部分瓣膜垫从心脏壁或间隔分裂出来，产生可自由活动的瓣叶。我们最近发现斑马鱼的上房室瓣也通过分层形成。在形成ECM内的细胞双层后，这些细胞下调血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin），同时保留紧密连接以维持上皮完整性。随后该双层细胞发生复极化，重新表达VE-cadherin并分裂，通过间质-内皮转化（MEndoT）释放出一个仅两层细胞厚的瓣叶。分层后，引导内皮细胞集体迁移的细胞在新生瓣叶基部增殖，产生迁移到瓣膜间质空间的细胞，并进一步增殖、分化为VICs。
在小鼠和鸡中，腱索在分层期间开始形成并在之后继续成熟。分层后，心肌细胞仍存在于新形成瓣叶的表面，随后经历凋亡并被瓣膜内皮细胞取代。斑马鱼不发育腱索，取而代之的是附着于房室瓣基部的紊乱的小梁带，大约在104 hpf首次出现，并随着心脏成熟而逐渐清晰。
瓣膜伸长、变薄与细胞外基质重塑
瓣膜发育的最后一步涉及瓣叶的伸长、变薄以及ECM重塑。此阶段没有显著的细胞凋亡。在小鼠和鸡中，心内膜垫甚至在瓣叶完全分层之前就开始伸长。在细胞水平上，这涉及二尖瓣和三尖瓣原基远端的细胞增殖增加。随着发育进行，分散的间充质细胞群凝聚成更致密的细胞结构，这种凝聚首先出现在瓣叶的心房侧，然后向心室侧延伸。在凝聚过程中，ECM调节分子的表达受到限制，从而在瓣叶内形成不同的细胞区室，使得有组织的结缔组织得以形成。当瓣叶接近其成年长度时，细胞增殖减少。同时，ECM开始分层。心脏瓣膜的ECM分层持续到幼年阶段，形成三层结构。
除了由EndoMT产生的间充质细胞外，心外膜来源和神经嵴来源的间充质细胞也贡献于成熟房室瓣叶的瓣膜间质细胞群。在斑马鱼中，上、下瓣叶持续伸长直至受精后90天。细胞增殖主要发生在瓣膜的远端尖端。谱系追踪表明，神经嵴来源的细胞在10 dpf后被同化入VICs。斑马鱼瓣膜在伸长过程中经历显著重塑，特别是其ECM从富含纤连蛋白和透明质酸的促迁移型ECM，转变为从20 dpf起富含弹性蛋白1的柔韧ECM。尽管斑马鱼再生能力很强，但瓣膜狭窄仍会自然发生于老年斑马鱼中。
生物力学线索的作用
心脏在生长和重塑过程中持续泵血，长期以来人们认为心脏内的血流动力学应力可能提供形态发生线索来引导瓣膜发育。这一假设得到了许多优秀体外研究的支持，这些研究表明内皮细胞和VICs都对壁剪切应力、拉伸应力和压缩应力有反应。
在鸡模型中的早期工作主要通过手术干预（如卵黄静脉结扎、左心房结扎、流出道束带术）来改变生物力学力。这些开创性研究确立了生物力学力在房室瓣发育中的重要性。更近期的研究结合计算流体动力学建模和现代分子生物学技术，表明壁剪切应力模式与瓣膜特异性基因的表达相关，并且扰动生物力学力会改变机械敏感基因（如TGF-β受体III、KLF2、YAP）以及各种ECM蛋白的表达。
小鼠因其与人类心脏解剖结构的相似性，是剖析房室瓣发育过程中机械敏感信号通路遗传成分不可或缺的模型。关键的机械敏感基因，包括KLF、WNT、NOTCH、NFAT和YAP，在小鼠房室瓣发育过程中表达。例如，内皮细胞Klf2缺失会导致Wnt9b表达丧失和邻近间充质细胞中经典WNT信号减少，从而引起房室瓣形成缺陷。另一个KLF转录因子KLF4，在E9.5时表达于房室管心垫的末端，它抑制EndoMT。有趣的是，其表达模式受机械敏感的初级纤毛调控。在壁剪切应力最高的心垫中央区域，内皮细胞失去纤毛，导致KLF4下调，从而允许EndoMT进行。
斑马鱼模型在理解生物力学力在房室瓣发育中的作用方面取得了显著进展。斑马鱼胚胎外部受精且高度透明，便于活体成像、基于图像的力建模以及血流的显微手术扰动。早期研究表明，用心内微珠阻塞血流会阻止房室瓣发育的启动。随后的研究试图区分剪切应力、血流模式、应变、压力和心肌活动在房室瓣发育中的作用。迄今为止，研究大多阐明了壁剪切应力在房室瓣发育中的重要性。例如，2D+时间模拟表明，48 hpf胚胎中沿房室管的振荡壁剪切应力的空间变化对于启动房室瓣形成很重要。缺乏血细胞的gata1突变体在房室管处承受的最大壁剪切应力约为对照组的1/4到1/3，其表现出不完全外显的、紊乱的心内膜垫表型，并且常在瓣膜分层时出现错误，导致在4 dpf时瓣膜增厚。向血流中注射粘性介质可以部分拯救gata1突变体的厚瓣膜表型，这支持了壁剪切应力调节瓣膜分层的假设。
各种力敏感离子通道，包括TRP通道、PKD通道和Piezo通道，都参与斑马鱼房室瓣发育。这些离子通道调节房室内皮中klf2a和/或klf2b的表达。Klf2a/b对于细胞初始迁移入ECM和分层都很重要。与小鼠不同，斑马鱼中Klf2a和Notch在即将内迁的细胞邻近的房室内皮细胞中表达。内皮细胞之间通过Notch介导的侧向抑制，筛选出Delta-like-4阳性的内皮细胞，并定义了内皮细胞迁移入心胶质的位点。Delta-like-4阳性内皮细胞的迁移依赖于Wnt9a，后者通过Erk5-Klf2-Wnt9a信号级联平行产生。另一个主要的机械转导通路是Ca2+/钙调神经磷酸酶/Nfatc1信号通路。生物力学力已被证明能激活房室内皮中的钙振荡，从而驱动Nfat活性。这些Ca2+振荡依赖于ATP和嘌呤能受体的存在。与小鼠不同，Nfat活性仅在斑马鱼的内皮细胞中观察到。在发育的不同阶段药理性抑制钙调神经磷酸酶会产生不同的表型。从48 hpf开始处理会阻止内皮细胞迁移入心胶质，导致瓣膜发育不全；而从60 hpf开始处理则会阻止正常的瓣膜分层，导致瓣叶增厚、增生。
展望
准确描述心脏发育每个阶段的正常生物力学力，并理解在发育不同阶段改变这些力如何影响形态发生，对于改进先天性心脏病的宫内手术干预以及就服用影响胚胎心脏功能的药物做出明智决定至关重要。未来研究需要理解力在瓣膜发育后期阶段的作用，并需要确定这些基因和离子通道如何修改驱动瓣膜形态发生的细胞行为。随着CRISPR/Cas9技术的进步，有望克服鸡模型中缺乏转基因品系的障碍；而胚胎培养和活体成像技术的改进，将使小鼠心脏发育后期阶段的研究成为可能。同时，斑马鱼为整合活体成像、机械扰动与新兴工具（如用于监测Piezo依赖活性的GenEPi转基因报告系统，以及绘制瓣膜形态发生过程中组织应力的基于图像的有限元建模方法）提供了一个强大系统。
结论
房室瓣发育是机械负荷下形态发生的一个突出例子。小鼠、鸡和斑马鱼之间以及同一心脏内不同瓣叶形成方式的差异表明，瓣膜形成并不遵循单一保守途径，而是受一系列发育程序调控。尽管存在差异，一种保守的机械敏感逻辑已然显现。机械力通过力敏感离子通道、初级纤毛以及KLF、NOTCH、NFAT等机械转导通路被解读。这些通路并非孤立作用，而是相互交汇，在时空上调控细胞的迁移、增殖和分化等行为。重要的是，机械信号并不取代如BMP信号这样的生化模式线索；相反，现有证据支持一种混合模型，即遗传预模式化定义了瓣膜形成潜能的区域，而血流动力学力则在这些区域内细化细胞命运决定并塑造组织结构。新出现的证据表明，这些机械敏感通路的失调不仅可能导致先天性瓣膜缺陷，也可能参与适应性和退行性瓣膜疾病。揭示生物力学力在瓣膜发育过程中的确切作用，是一个令人兴奋且快速发展的研究领域。
