《Journal of Fungi》：New Insights from Two Historic Boletellus-Type Specimens in China Based on Next-Generation Sequencing
Bing-Qian Yang,
Hong-Kang Shen,
Yang Wang,
Xin Zhang,
Fa-Ming Long,
Yi-Lin He,
Yan-Chun Li,
Gang Wu and
Jing Zhou
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本研究针对中国早期描述的两个Boletellus物种（B. serpentipileus 和 B. vulgaris）分类学归属不清的问题，整合了NGS、Sanger测序与形态学重检，揭示了二者实为Leccinum和Austroboletus属的成员。该研究解决了长期存在的分类学争议，并为利用基因组浅层测序技术研究历史标本提供了成功范例，对准确理解中国牛肝菌多样性具有重要意义。
在真菌的世界里，牛肝菌（Boletales）以其独特的形态和风味备受青睐，而Boletellus属则是其中一个颇具辨识度的类群，其关键特征在于担孢子表面具有纵向条纹状纹饰。近年来，中国Boletellus属的物种多样性得到了较好的记录，然而，一些由我国早期真菌学家描述的历史物种，却因年代久远和研究手段局限，其分类学地位长期悬而未决，仿佛蒙上了一层神秘的面纱。其中，两种分别于1999年和1982年发表的物种——蛇盖条孢牛肝菌（B. serpentipileus）和普通条孢牛肝菌（B. vulgaris）——便是如此。它们自发表以来，其基于传统形态学的分类是否正确，一直缺乏后续的验证。这种分类学上的不确定性，不仅影响了我们对这两个具体物种的认识，也为准确理解中国牛肝菌的整体多样性设置了一道障碍。
为了拨开这层历史迷雾，一个研究团队在《Journal of Fungi》上发表了一项研究。他们决定采用一种名为基因组浅层测序（Genome-Skimming）的下一代测序（NGS）技术，对这两种历史模式标本的“遗骸”进行基因“考古”。这种技术能够以较低的成本和较高的效率，从陈旧的标本中获取构建系统发育树所需的多个基因序列，堪称是历史标本研究的“利器”。研究人员整合了NGS数据、传统的桑格（Sanger）测序数据，并重新审视了标本的微观形态特征，对这两种历史Boletellus物种的分类身份进行了一次全面的“体检”和“重审”。
这项研究最终揭晓了令人意外的“身世之谜”。通过构建多基因系统发育树，研究人员发现，B. serpentipileus 并不属于Boletellus属，而是与Leccinum属（疣柄牛肝菌属）的物种亲缘关系更近，应被重新组合到该属下，成为Leccinum serpentipileum。而B. vulgaris则被归入了Austroboletus属（南牛肝菌属），并且与已知物种A. fusisporus在形态和分子上高度一致，因此，B. vulgaris被视为A. fusisporus的一个异名。这一发现解决了长达数十年的分类学疑问，修正了过去的错误认知，为更准确地理解中国牛肝菌的多样性谱系做出了重要贡献。
为了达成研究目标，研究人员主要应用了以下几种关键技术方法。首先，在形态学表征方面，他们重新检查了存放于中国科学院昆明植物研究所隐花植物标本馆和广东省微生物研究所真菌标本馆的历史模式标本，利用光学显微镜和扫描电子显微镜观察了子实体的显微结构。其次，在分子数据获取上，他们采用了桑格测序和下一代测序（NGS）相结合的策略。对于超过20年历史的B. serpentipileus和B. vulgaris模式标本，由于DNA降解严重，桑格测序效果不佳，转而采用NGS技术（基于MGI DNBSEQ-T7平台）进行全基因组浅层测序，以获取核糖体内部转录间隔区（ITS）、大亚基（nrLSU）、RNA聚合酶II最大亚基（rpb1）、第二大致亚基（rpb2）和延伸因子1-α（tef1-α）等基因序列。最后，在系统发育分析中，他们利用MAFFT、trimAl、PhyloSuite等软件对多基因序列进行比对、修剪和串联，并采用最大似然法（ML）和贝叶斯推断法（BI）构建了高支持度的系统发育树，以确定目标物种在属级水平上的精确位置。
分子系统学分析结果
通过NGS技术，研究人员从两份历史模式标本中成功获得了多个基因片段。系统发育分析结果显示：
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B. serpentipileus 的模式标本（KUN-HKAS31116）在系统发育树上并未与Boletellus属的物种聚在一起，而是清晰地嵌套在Leccinum属内部，并与来自法国的L. aurantiacum形成姐妹群，支持其归属于Leccinum属。
- 2.
B. vulgaris 的模式标本（GDGM4454）同样位于Boletellus属之外，而是与Austroboletus属的A. fusisporus聚在同一个高支持度的分支内，且序列高度相似，表明二者应为同一个物种。据此，提出了将B. serpentipileus转移至Leccinum属的新组合Leccinum serpentipileum，并将B. vulgaris作为A. fusisporus的异名处理。
模式标本的形态学重检结果
- 1.
B. serpentipileus的形态特征：对保存状况欠佳的正模标本进行重检发现，其担孢子光滑、呈狭椭圆形（16–19 × 4–6 μm），这与原描述中“具纵向条纹纹饰”的特征不符，却与Leccinum属的特征（光滑担孢子、菌柄被鳞片）相符，为其归入该属提供了形态学支持。研究进一步基于新近采集的标本，对该物种进行了更完整的形态学描述，确认了其中等至大型的子实体、橙黄色至黄棕色的菌盖、菌肉受伤不变色或微变红、光滑的椭圆形担孢子以及交织的粘毛皮层等特征。
- 2.
B. vulgaris的形态特征：对正模标本的重检确认，其担孢子为梭形、表面具疣状纹饰（13–15(–16) × 8–10 μm），与原始描述一致。但其粉红色的菌管和具网纹的菌柄等特征，与当代对Boletellus属的界定（孢子具纵向条纹）相矛盾，而与Austroboletus属相符。研究结合其他标本，对A. fusisporus（即B. vulgaris的异名）进行了补充描述，强调了其子实体小型、菌盖粘、被绒毛、菌肉白色不变色、菌管粉红色、菌柄具浅褐色网纹等鉴别特征。
研究结论与讨论
本研究通过对B. serpentipileus和B. vulgaris两份历史模式标本的综合分析，得出了明确的分类学修订结论：B. serpentipileus应归属Leccinum属，而B. vulgaris是A. fusisporus的晚出异名。这一结论得到了分子系统发育学和形态学证据的双重支持。
在讨论中，作者分析了造成初始分类错误的原因。对于B. serpentipileus，早期研究者（Zang等人，1999年）可能因观察误差，将其光滑的孢子误判为具纵向条纹，从而将其置于Boletellus属。本研究的重检和分子数据共同纠正了这一错误。对于B. vulgaris，Bi等人（1982年）将其归入Boletellus属的Allospori组，是基于当时更宽泛的属级界定（即Boletellus可包含孢子光滑、具网纹、疣状或纵向条纹的物种）。随着Boletellus属被重新界定为仅包含孢子具纵向条纹的物种，B. vulgaris的分类地位自然需要重新评估。本研究的NGS数据清晰地将其定位在Austroboletus属内，并与A. fusisporus对应，其形态特征（粉红色菌管、具网纹菌柄、疣状孢子）也完全支持这一修订。
更重要的是，这项研究成功验证了NGS技术应用于老旧标本（超过20年）基因组数据获取的可行性。尽管标本保存状态不佳，基因组组装完整性不理想，但通过基因组浅层测序策略，仍能高效获取足够用于系统发育分析的多基因数据。这不仅为基于标本馆历史收藏开展分类学研究提供了有力的技术支撑，也为未来利用这些珍贵材料进行谱系地理学和进化历史研究开辟了新的可能性。最终，这项研究澄清了长期存在的分类学不确定性，推动了牛肝菌科真菌分类系统的完善，也为更精准地理解中国的牛肝菌多样性做出了实质贡献。
