靶向SARS-CoV-2的新型吡唑并嘧啶/三唑并嘧啶衍生物：PZP25的体外高效抗病毒活性与机制研究

《Pathogens》：Antiviral Activity of Pyrazolopyrimidine and Triazolopyrimidine Derivatives Against SARS-CoV-2 In Vitro: Identifying PZP25 as a Promising Scaffold Saiqa Sardar, Jessica S. C. C. Martins, Thiago C. Sousa, Andreon S. M. Silva, Marcelo A. Pinto, Flávia F. Silveira, Thais B. Silva, Rodolfo R. F. Fran?a, Luiz C. S. Pinheiro and Leonardo J. M. Carvalho + 3 authors

本研究针对COVID-19治疗中新型高效抗病毒药物的迫切需求，对一系列吡唑并嘧啶（PZP）和三唑并嘧啶（TZP）衍生物进行体外筛选。结果表明，多个化合物在100 μM浓度下可有效抑制SARS-CoV-2复制，且无细胞毒性。其中，PZP25展现出强效抗病毒活性（IC50= 8.2 μM）和优异选择性（选择性指数 > 100），机制研究提示其作用发生在病毒感染后阶段。该研究为开发靶向冠状病毒的新型抗病毒先导化合物提供了有前景的化学骨架。

　　

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的全球大流行，在带来公共卫生危机的同时，也极大地加速了疫苗和疗法的研发进程。尽管已有多种疫苗和少数抗病毒药物（如瑞德西韦和奈玛特韦）获批使用，但现有药物临床获益有限，且病毒的持续变异对治疗构成了新的挑战。因此，全球科研界仍在孜孜不倦地寻找具有新作用机制、高效且广谱的抗冠状病毒药物。这项发表于国际期刊《Pathogens》的研究，正是基于此背景，从已知具有抗疟活性的化合物家族入手，探索其对SARS-CoV-2的抗病毒潜力，试图为抗击COVID-19乃至未来可能出现的冠状病毒疫情发掘新的“武器弹药”。

为了评估候选化合物的抗病毒活性，研究人员采用了标准的体外细胞模型。他们首先利用非洲绿猴肾上皮细胞（Vero E6）建立了SARS-CoV-2（武汉株B.1.1.33）的感染模型。研究的核心是筛选20种化合物，包括一个先前通过计算机模拟预测有潜力的吡唑并吡啶-磺胺衍生物（L87/PPS2）、5个吡唑并嘧啶（PZP）衍生物和14个三唑并嘧啶（TZP）衍生物。在初步筛选中，他们使用空斑减少实验和定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）两种方法，在100 μM浓度下评估化合物抑制病毒复制的能力。为了确定活性化合物的效力，对其中最具潜力的PZP25进行了半数抑制浓度（IC₅₀）的测定。同时，通过乳酸脱氢酶（LDH）释放实验评估了所有化合物在测试浓度下的细胞毒性，以计算其选择性指数。为了初步探究化合物的作用阶段，研究人员对PZP25进行了精心设计的时间加药实验，比较了病毒感染前预处理细胞或病毒、病毒感染期间处理以及感染后持续处理等不同条件下化合物的抗病毒效果。

3.1. PZP和TZP衍生物在体外对SARS-CoV-2表现出抗病毒活性

研究人员首先在100 μM浓度下对所有20种化合物进行了抗SARS-CoV-2活性筛选。结果显示，12种化合物表现出中到强的抗病毒活性，其中PZP家族的PZP25、PZP27、PZP28、PZP29以及TZP家族的TZP10、TZP12、TZP17、TZP18、TZP19、TZP20、TZP22等能抑制65%至100%的病毒复制。而PPS2（L87）仅显示出约45%的部分抑制。值得注意的是，在100 μM浓度下，所有测试化合物对Vero E6细胞均未表现出可检测到的细胞毒性（LDH释放无显著增加）。这些结果在随后的第二轮采用RT-PCR方法进行的验证性筛选中得到了基本印证。初步的构效关系分析表明，对于TZP化合物，在[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶核的第2位连接三氟甲基（CF₃）基团，或在苯磺酰胺部分具有萘环结构，与强抗病毒活性相关。而所有测试的PZP化合物在100 μM下均表现出强活性。

3.2. PZP25对SARS-CoV-2表现出抗病毒活性和低细胞毒性

在初步筛选的基础上，研究人员选择活性突出的PZP25进行深入表征。通过浓度-反应曲线测定，PZP25对SARS-CoV-2复制的半数抑制浓度（IC₅₀）为8.2 μM。细胞毒性实验显示，即使在高达800 μM的浓度下，PZP25也未引起显著的LDH释放，其半数细胞毒性浓度（CC₅₀）大于800 μM，由此计算出的选择性指数大于100，表明该化合物具有较宽的治疗窗口和良好的安全性。

3.3. 持续暴露于PZP25是产生强效抗病毒活性所必需的

为了探究PZP25可能的作用阶段，研究人员进行了时间加药实验。结果显示，最具效果的给药方式是在病毒感染细胞后持续给予PZP25（“感染后处理”），这能几乎完全抑制病毒复制，使病毒RNA水平降至检测限以下。如果在病毒吸附细胞的1小时内同时加入化合物（“处理期间”），也能观察到约65%的显著抑制。然而，预先用PZP25处理病毒（“病毒预处理”）或处理细胞（“细胞预处理”）后再感染，均未能显著降低病毒复制水平。有趣的是，与病毒“处理期间”的方案相比，预先将病毒与药物共孵育反而会减弱PZP25的抗病毒效果。这些结果表明，PZP25的抗病毒作用需要其在病毒感染细胞的过程中或之后持续存在才能完全发挥，其作用靶点可能涉及病毒进入细胞后的某个或某些复制步骤，而非直接灭活病毒颗粒或永久性地改变细胞的易感性。

研究的讨论与结论部分总结了本次发现的重要意义。首先，这项工作成功地将一个已知具有抗疟活性的化合物家族（PZP/TZP）的应用范围扩展到了抗冠状病毒领域，为药物“老药新用”和骨架跃迁策略提供了实证。其次，研究强调了计算化学预测与实验验证相结合的重要性：尽管计算机模拟高度看好的先导化合物PPS2在体外仅表现出中等活性，但基于同骨架衍生物的筛选却发现了活性更优的PZP25，凸显了体外实验在药物发现中的不可替代性。再者，对PZP25的深入表征揭示了其良好的体外活性与选择性，以及其作用于病毒感染后阶段的特点，这为后续的机制研究（例如是否靶向病毒3CL蛋白酶或RNA依赖的RNA聚合酶等）和结构优化指明了方向。构效关系的初步分析为未来设计更高效的衍生物提供了线索，例如，可以尝试合成同时结合CF₃基团和萘环的TZP杂交分子。当然，研究也存在局限，例如使用的是Vero E6细胞系，其干扰素应答不完全，未来需要在人源呼吸道上皮细胞等更接近生理的模型中进行验证；PZP25的具体分子靶点尚不明确，其抗病毒谱（尤其是对变异株的效果）也有待评估。

总而言之，这项研究鉴定出了一类新型的吡唑并嘧啶和三唑并嘧啶衍生物，它们在体外能有效抑制SARS-CoV-2复制，且细胞毒性低。其中，化合物PZP25展现出作为先导化合物的良好潜力。这些发现不仅为开发针对COVID-19的新型治疗药物提供了有前景的化学起点，也为应对未来可能出现的其他冠状病毒威胁储备了候选分子库，是抗病毒药物发现领域一项有价值的基础研究工作。