《Acta Biomaterialia》：Polypyrrole nanozymes with cell-free DNA scavenging and ferroptosis inhibition capabilities for the treatment of acetaminophen-induced acute liver injury
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纳米酶PPy-Mg NPs通过螯合反应合成，用于治疗APAP过量引发的急性肝损伤（AILI）。研究显示，该纳米酶可靶向肝脏，有效清除活性氧自由基（RONS）和游离DNA（cfDNA），抑制铁依赖性细胞死亡（ferroptosis）和凋亡，并调节NF-κB/Nrf2-Keap1炎症信号通路，显著改善延迟性AILI小鼠模型。
刘宇|肖子文|张宇|陈倩|罗思雨|王瑶青|苗照华|陶振超|龚德燕
合肥工业大学食品与生物工程学院，中国合肥230009
摘要
急性肝衰竭（ALF）可能是由对乙酰氨基酚（APAP）过量服用引发的急性肝损伤逐渐发展所致。其核心机制包括抗氧化系统的失衡和炎症反应的上调，这些因素共同导致铁死亡/细胞凋亡。本文中，通过聚吡咯纳米颗粒（PPy NPs）与镁离子之间的配位反应合成了纳米酶（PPy-Mg NPs）。研究探讨了这种富集的PPy-Mg NPs作为有效的抗炎纳米酶在急性肝损伤治疗中的应用。富集的阳离子PPy-Mg NPs在肝脏中能够有效清除过量的活性氧和氮氧化物（RONS）以及游离DNA。值得注意的是，在延迟性急性肝损伤（AILI）的小鼠模型中，生物活性的PPy-Mg NPs不仅降低了氧化应激水平，还调节了多种生物信号通路，如NF-κB、Nrf2-Keap1和铁死亡/细胞凋亡。研究表明，PPy-Mg NPs纳米酶在急性肝损伤的治疗中具有潜在的医学应用价值。
重要性声明
对乙酰氨基酚引起的肝损伤（AILI）可能进展为急性肝衰竭（ALF），这构成了一个重大的临床挑战。目前，N-乙酰半胱氨酸（NAC）是唯一获批的治疗药物；然而，其对晚期AILI患者的疗效仍不尽如人意。因此，开发新的治疗方法对于AILI的治疗至关重要。本研究开发了一种PPy-Mg NPs纳米酶，用于高效治疗AILI。基于聚吡咯的纳米酶在AILI治疗中具有广泛的应用前景，包括上游代谢修复（清除RONS）、坏死碎片清除（去除cfDNA）以及残余细胞保护（抑制铁死亡），在时间和空间维度上都展现出潜在的优势，有望延长治疗窗口并提高高风险/复杂病例的保护率。
引言
由于对乙酰氨基酚（APAP）具有显著的解热和镇痛作用，它在全球临床实践中被作为一线镇痛药广泛使用[1]。该药物有多种给药形式，包括单一制剂、复合制剂，以及与咖啡因、抗组胺药或非处方/处方阿片类药物联合使用。需要注意的是，APAP仅在推荐剂量下才是安全有效的。过量服用会直接导致药物性肝损伤（DILI）[2,3]。一个典型的药理毒理学案例是，APAP引起的肝损伤（AILI）可能发展为急性肝衰竭（ALF），这会带来严重的临床管理问题[4]。目前唯一获批的AILI治疗药物是N-乙酰半胱氨酸（NAC）[5]，但它无法解决AILI晚期的无菌炎症反应[6,7]。因此，开发新的AILI治疗方法具有重要的临床意义。
APAP过量摄入会导致N-乙酰-p-苯醌胺（NAPQI）的过量产生，从而显著消耗肝脏中的谷胱甘肽（GSH）资源，进而导致有害的活性氧/氮氧化物（RONS）大量积累[8,9]。同时，谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4，一种抑制铁死亡的关键酶）需要GSH作为底物来清除脂质过氧化物；GSH的耗尽会直接导致GPX4功能失调[10]。此外，积累的Fe2?通过芬顿反应生成大量的羟基自由基，并同时激活脂氧合酶。这些过程共同催化细胞膜中多不饱和脂肪酸的过氧化，产生有毒的脂质过氧化物，如4-羟基-2-壬烯醛（4-HNE）和丙二醛（MDA）。这会破坏膜完整性，最终引发肝细胞的铁死亡[11][12][13]。最近的研究表明，铁死亡是一种由脂质过氧化驱动的依赖铁的细胞死亡方式，在AILI中是主要的肝细胞死亡机制[14]。细胞损伤或死亡后释放的损伤相关分子模式（DAMPs）会引发无菌炎症，其中游离DNA（cfDNA）会结合到免疫细胞表面的TLR9上，显著加剧炎症反应[15][16][17]。在AILI的背景下，循环中的cfDNA水平与肝细胞损伤和炎症的程度密切相关，表明其可能成为治疗靶点[18,19]。
纳米酶的生物医学应用不断扩展[20][21][22][23][24][25]。近年来，我们的团队专注于开发纳米药物及其在消化道疾病识别和管理中的生物医学应用[26][27][28][29][30]。此外，我们的团队还报道了一种具有肝脏靶向性和清除RONS能力的WS2@TA NSs纳米药物，用于治疗AILI[31]。基于聚吡咯的纳米酶已被证明具有治疗癌症和消化道问题的潜力[32][33][34]。其中，新兴的聚吡咯纳米颗粒（PPy NPs）能够通过提供电子/活性氢来直接阻断氧化损伤，从而中和RONS。受到PPy NPs卓越催化活性（CAT和SOD）的启发，我们的团队开发了一种含有PPy NPs纳米酶和抗纤维化药物吡非尼酮的益生元菊粉水凝胶（PPy/PFD@Inulin）。这种制剂通过持续清除RONS，有效降低了促炎细胞因子的水平，缓解了炎症性肠病（IBD）及其纤维化并发症[28]。镁离子（Mg2?）作为酶的辅因子和细胞功能的调节剂，在许多生理过程中发挥着不可或缺的作用。Mg2?可以缓解内质网应力，保护线粒体，并有效抑制铁死亡[35,36]。因此，开发能够同时恢复GSH储备、抑制炎症因子释放并有效调节关键信号通路的纳米酶，已成为该领域亟待解决的技术问题。
鉴于cfDNA在AILI中作为DAMP的作用以及铁死亡在APAP诱导的ALI中作为肝细胞死亡的主要机制，我们假设一种既能清除cfDNA又能抑制铁死亡的双功能纳米酶将提供协同治疗效果。先前的研究报道了Mn3O4纳米酶主要通过清除活性氧（ROS）和抗炎作用来减轻AILI[25]。我们的纳米酶在此基础上增加了清除cfDNA的能力，从而不仅解决了氧化应激和铁死亡问题，还解决了由cfDNA驱动的炎症放大问题。为了验证这一假设，我们通过PPy NPs与镁离子的配位反应合成了纳米酶（PPy-Mg NPs）。首先，我们表征了PPy-Mg NPs的物理化学性质和酶样活性，然后在细胞模型中评估了其清除cfDNA和抗铁死亡的效果，最后在AILI的小鼠模型中检验了其治疗效果和作用机制。如图1所示，阳离子PPy-Mg NPs作为一种强大的活性纳米酶，能够有效清除cfDNA和RONS，抑制炎症因子，从而实现高效的AILI治疗。由于尺寸效应，PPy-Mg NPs在静脉注射后能够有效地富集在受损的肝脏部位。更重要的是，在延迟性AILI小鼠模型中，生物活性的PPy-Mg NPs不仅降低了氧化应激水平，还调节了多种生物信号通路，如NF-κB、Nrf2-Keap1和铁死亡/细胞凋亡，从而成功缓解了延迟性AILI。
材料与方法
聚吡咯购自上海阿拉丁生化科技有限公司；3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)2,5-二苯基溴四唑（MTT）购自Thermo Fisher Scientific Inc.；Calcein-AM/PI购自Beyotime Biotechnology Company；CST抗体：anti-ACSL4、anti-NF-κB、anti-Keap1、anti-IκBα、anti-p65、anti-Nrf2和anti-SLC7A11；anti-GPX4购自Abcam。所有试剂均直接使用，无需进一步处理。所有动物实验均获得了相关伦理许可。
PPy-Mg NPs的制备与表征
PPy-Mg NPs是通过PPy NPs与镁离子的配位反应合成的（图1a）。首先，我们确认了所合成的纳米酶是否具有后续功能测试所需的预期结构特性。采用透射电子显微镜（TEM）和热场发射扫描电子显微镜（SEM）来表征PPy-Mg NPs的形态。代表性的TEM和SEM图像显示，获得的PPy-Mg NPs具有特定的粒径
结论
总结来说，我们通过基于配位的方法开发了一种分散性好且粒径均匀的PPy-Mg NPs纳米酶。所得到的PPy-Mg NPs具有强大的抗氧化效果和高效的肝脏富集能力。PPy-Mg NPs可以有效地被排出体外，确保其用于AILI治疗的安全性。更重要的是，在延迟性AILI小鼠模型中，PPy-Mg NPs能够激活Keap1-Nrf2通路并抑制NF-κB通路，清除过量的RONS和cfDNA，从而抑制炎症细胞因子的释放。
作者贡献声明
刘宇：撰写——初稿、可视化、验证、研究、数据分析。肖子文：撰写——初稿、可视化、验证、研究。张宇：撰写——审稿与编辑、可视化。陈倩：可视化。罗思雨：撰写——审稿与编辑。王瑶青：撰写——审稿与编辑。苗照华：撰写——审稿与编辑、监督、数据分析。陶振超：撰写——审稿与编辑、资源准备、方法学设计。
