《Analytica Chimica Acta》：A Digital Microfluidics-Based Single-Cell ddPCR Platform for High-Throughput Gene Copy Number Analysis Applied to Single Cultured Cells
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数字微流控（DMF）平台通过集成液滴操控、样本处理和核酸扩增，实现单细胞水平基因拷贝数变异（CNVs）的高灵敏度检测，性能与商用系统相当，为临床诊断和个性化医学提供创新工具。
孙一成|梁建聪|李慧|范叶晨|彭特|胡思怡|高远|赵文丽|姜玲|Khadija Urooj|马汉斌|史慕德|毕恩光
中国广东省广州市南方医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系，邮编510515
摘要
数字聚合酶链反应（dPCR）是一种用于核酸绝对定量的强大工具，其灵敏度高于定量PCR（qPCR）。然而，目前的dPCR平台由于液滴控制和可视化能力有限，难以在单细胞水平上检测基因拷贝数变异（CNVs）。为了解决这些问题，我们开发了一种基于数字微流控（DMF）的平台，该平台将液滴操作、样本处理和核酸扩增整合到了一个完全可控的工作流程中。DMF芯片配备了16,384个可寻址电极，能够精确操控含有单个细胞的纳升级液滴，支持芯片上的细胞裂解、液滴合并和分离，且无需复杂的工作流程。通过使用细胞系，我们验证了该平台在qPCR和dPCR方面的能力，并实现了单细胞分辨率。为了展示其临床应用价值，我们将该平台应用于原代嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞），成功地在单细胞水平上定量了载体拷贝数（VCNs），其性能可与商业dPCR系统相媲美。这种高度集成且高通量的平台减少了样本损失和污染，同时提供了实时可视化和可扩展性。我们的基于DMF的dPCR系统为单细胞遗传分析提供了强大的工具，在临床诊断、个性化医疗和研究领域具有广泛的应用潜力。
引言
数字聚合酶链反应（dPCR）在绝对定量和灵敏度方面相较于传统的定量PCR（qPCR）具有显著优势，使其成为在各种应用中（包括临床诊断[1]、[2]、[3]、[4]）精确检测微量核酸不可或缺的工具。其提供精确的分子水平定量的能力使dPCR成为一系列诊断和治疗应用中的有前景的技术，尤其是在检测低丰度遗传标记和罕见突变[5]、[6]、[7]方面。传统的dPCR平台依赖使用微孔或微腔等物理结构将样本分割成微滴[8]、[9]。虽然这种方法可以实现基于液滴的核酸扩增，但它缺乏对液滴分布的精细控制，从而复杂化了工作流程并降低了实验可视化的程度。此外，常规系统通常只输出来自细胞群体的平均结果，限制了其在单细胞水平上检测拷贝数变异（CNVs）的灵敏度。因此，该领域的一个关键挑战是利用dPCR的单分子灵敏度进行高精度的单细胞分析。
数字微流控（DMF）技术的出现通过使用电场来操控液滴，解决了压力驱动微流控的几个局限性[10]、[11]。这种电场驱动的方法消除了对机械泵或阀门的需求，并显著简化了芯片制造。通过在单一平面设备上实现液滴生成、分离、合并和传输，DMF可以在微尺度体积下促进广泛的生物反应，从而提高通量，减少样本损失，并允许多个步骤的稳健集成。当与适当的成像系统结合使用时，这些过程可以完全可视化且可控，提供了更大的实验灵活性。
基于我们之前的工作[12]、[13]、[14]、[15]，我们设计了一种DMF芯片，它结合了液滴操作的高通量能力和dPCR的高灵敏度。这种方法使得单个细胞可以被封装在纳升级液滴中，随后进行芯片上的样本处理和核酸扩增，从而最小化了样本处理、污染风险和仪器转移。首先，我们使用细胞系验证了该平台在单细胞水平上进行定性qPCR和定量ddPCR的能力。然后，我们将该平台应用于人原代嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞），成功地在单细胞水平上定量了载体拷贝数（VCNs），从而突显了我们的基于DMF的dPCR系统在临床相关应用中的潜力。
实验部分
试剂。QuantStudio? 3D数字PCR Master Mix v2（A26358，Thermo Fisher Scientific，中国上海）购自Thermo Fisher Scientific。HiScript III U+ One Step qRT-PCR Probe Kit（Q225，Vazyme，中国南京）购自南京Vazyme Biotech有限公司。所有引物和TaqMan探针均由Genewiz China（中国苏州）合成。QuantStudio? 3D dPCR master mix和微孔芯片也购自Thermo Fisher Scientific（中国上海）。结果分析
荧光图像使用NIS-elements BR 5.42.04（Nikon Instruments Inc.，美国）和GraphPad Prism 8.0进行处理。在定义的区域内测量单个液滴的荧光强度，并根据强度阈值将液滴分类为阳性或阴性。记录阳性液滴和阴性液滴的数量，并根据以下公式计算拷贝数：对于单组分检测：C（每个细胞的拷贝数）= Pt
对于多组分检测：C
结果与讨论
基于DMF的芯片PCR平台的构建。为了满足数字PCR（dPCR）应用的要求，我们开发了一个集成了显微镜成像、荧光成像、三轴位移控制和温度调节的集成平台（图1A）。在之前的工作基础上，DMF芯片设计进行了优化，包含了16,384个可独立并行控制的电极。
结论
数字PCR（dPCR）在基因诊断、病原体检测和临床测量方面具有巨大潜力[1]、[8]。当前dPCR的一个挑战是缺乏在单细胞水平上检测基因拷贝数变异的有效方法。基于DMF的平台的开发为单细胞核酸样本的制备和检测提供了一种新的方法。在本研究中，我们介绍了一种将液滴微流控（DMF）与...CRediT作者贡献声明
姜玲：监督。赵文丽：监督、研究。彭特：研究。范叶晨：研究。高远：监督。胡思怡：写作——审稿与编辑、监督。史慕德：监督。孙一成：写作——初稿、研究、概念构思。马汉斌：监督、资金获取。李慧：写作——审稿与编辑、监督。梁建聪：写作——初稿、研究。Khadija Urooj：研究利益冲突声明
J. Liang、T. Peng、S. Hu、H. Ma和M. Shi是acxel Micro&Nano公司的员工。其余作者声明没有竞争利益。基于这项研究的专利已经提交。数据可用性
本研究没有生成或分析任何新的数据集、软件或自定义代码。支持本研究结果的数据可应要求向相应作者获取。创新性声明
在这项研究中，我们报告了一种完全集成的数字微流控（DMF）平台，该平台通过精确的纳升级液滴操控、实时可视化和芯片上的热循环实现了单细胞分辨率的数字PCR（ddPCR）。我们的DMF芯片配备了16,384个可寻址电极，便于进行可编程和高通量的液滴操作，包括单细胞封装、细胞裂解、试剂混合和液滴分离。利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。致谢
本研究得到了中国国家重点研发计划（2023YFF0721500和2024YFC3406900）、国家自然科学基金（82372775、82573475）、广东省科技计划（2025A0505010003）、广东省佛山市科技创新项目（编号1920001000047）以及广东省医学研究基金会（A2023131）的财政支持。
