《Applied Clay Science》：Investigation of biological pathway of cobalt-55-labeled layered double hydroxide depending on surface charge
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该研究通过表面电荷修饰和不同给药途径探究了层状双氢氧化物（LDH）纳米粒子的生物途径，利用钴-55放射性标记结合PET成像技术，发现LDH的生物分布和代谢受表面电荷及给药方式共同调控。
金泰贤（Tae-Hyun Kim）| 李俊英（Jun Young Lee）| 黄仁珠（Injoo Hwang）| 朴正勋（Jeong Hoon Park）
韩国大田汉巴特国立大学（Hanbat National University）化学与生物工程系，邮编34158
摘要
本研究利用钴-55（^55Co）研究了层状双氢氧化物（LDH）纳米颗粒的生物途径，这些途径受到表面电荷和给药途径的影响。通过传统的共沉淀法合成了原始的MgAl层状双氢氧化物（LDH）纳米颗粒，随后分别用柠檬酸根和琥珀酸根阴离子对其进行表面修饰，以获得负电荷和中等正电荷。放射性同位素^55Co成功标记在表面电荷修饰后的LDH纳米颗粒上。在磷酸盐缓冲液（PBS）和人血清中，标记的^55Co在48小时内保持稳定。体外细胞摄取结果表明，通过调节LDH的表面电荷可以调控其摄取和内化比例（膜/细胞内介质）。为了评估LDH颗粒在小鼠模型中的生物途径，通过两种不同的途径（口服给药和静脉注射）给予^55Co标记的LDH，并使用正电子发射断层扫描（PET）进行追踪。PET图像显示，LDH颗粒的生物途径取决于给药途径和表面电荷。
引言
药物的生物给药过程常常受到药物分子溶解度和渗透性的限制，这阻碍了它们在体液和器官（包括肿瘤）中的快速溶解和吸收（Kalepu和Nekkanti，2015；Loh等人，2015）。因此，药物递送系统受到了众多研究组的关注，这些研究组致力于提高药物疗效、实现靶向递送、确保药物分子的控释并最小化副作用（Bilal等人，2021；Siafaka等人，2016；Yamaguchi等人，2023；Zheng等人，2022）。药物递送研究主要涉及药物分子的封装和持续释放。多种药物递送载体，如脂质体（de Oliveira Silva等人，2023；Li等人，2023）、聚合物材料（Gorzkiewicz等人，2019；Wróbel等人，2023）、碳同素异形体（Hosnedlova等人，2019；Jain等人，2021；Lee等人，2021）以及金属（氢）氧化物纳米颗粒（Kim等人，2021；Parvathi等人，2024；Piao等人，2024；Ruddaraju等人，2019），已广泛应用于化疗领域。在选择药物递送载体时，必须考虑四个关键因素：i）靶向递送，ii）生物降解性，iii）延长循环时间，iv）易于工程化。
在上述药物递送载体中，层状双氢氧化物（LDH）纳米颗粒是研究最为深入的二维纳米材料之一，因为它们具有生物相容性、较大的长宽比、层间间距以及药物分子的持续释放能力，同时还具有特征性的正表面电荷（Cunha等人，2016；Kang等人，2015；Oh等人，2009；Tao等人，2006）。由于层状结构，金属氢氧化物层通过电荷补偿的层间阴离子逐层堆叠。LDH具有类似水滑石的结构，通用公式为[M^2+]_{1–x}M^3+_{x} (OH)_{2}^{x+}[A^{n–}]_{x/n}·yH_2O（M^2+：二价金属，M^3+：三价金属，A^{n–}：阴离子物种）（Vaccari，1998）。因此，LDH可以使用各种二价（Mg^2+、Co^2+、Cu^2+、Ni^2+、Fe^2+、Ca^2+等）和三价（Al^3+、Fe^3+、Cr^3+等）金属离子的组合来制备，并且可以插入多种阴离子物种（CO?^2?、NO?^?、Cl^?、SO?^2?等）（Forano等人，2006；Rives，2001）。特别是，插入的阴离子通过静电相互作用稳定在金属氢氧化物框架的层间区域。
许多研究人员在LDH的表面或层间空间引入了荧光素染料（Musumeci等人，2010；Oh等人，2011）和/或造影剂，以便追踪这些纳米颗粒。此外，还使用了计算机断层扫描（CT）（Jung等人，2021）、磁共振成像（MRI）（Li等人，2017）以及单光子发射计算机断层扫描（SPECT）（Kim等人，2020）和正电子发射断层扫描（PET）（Shi等人，2015；Li等人，2019）等成像技术来观察生物环境中的纳米颗粒。然而，应用于LDH表面或层间空间的荧光素染料和/或造影剂可能会脱落或释放到生物流体中，这引发了关于标记稳定性的担忧（Tanaka等人，2013）。为了解决这些问题并防止在生物系统中的错误检测，一些研究小组提出使用放射性同位素（RI）如^57Co^2+、^64Cu^2+、^90Y^3+通过无螯合剂标记方法对LDH进行牢固标记（Eom等人，2019；Eom等人，2022；Shi等人，2015）。先前的研究表明，^57Co^2+标记的LDH在生物流体中显示出高标记效率，并且对癌组织和肿瘤具有显著的靶向效果（Kim等人，2020；Kim等人，2016）。Xu和Cai团队报告了使用^64Cu^2+、^44Sc^3+和^89Zr^4+对牛血清白蛋白（BSA）包覆的LDH纳米颗粒进行无螯合剂标记，用于PET成像（Shi等人，2015）。值得注意的是，^64Cu^2+标记的LDH-BSA样品在磷酸盐缓冲液（PBS）和血清中的标记稳定性约为91%，持续24小时。与单独使用^64Cu^2+-BSA相比，该样品显示出更高的肿瘤摄取率和更清晰的PET成像结果。此外，^64Cu^2+标记的LDH是通过同质取代制备的，然后在其表面包覆BSA用于PET成像（Eom等人，2022）。这种配方表现出更好的胶体稳定性、更长的血液循环时间和更高的肿瘤摄取率。总体而言，这些研究突显了LDH作为联合成像和药物递送应用的多功能平台的潜力。
关于颗粒大小对纳米颗粒行为的影响已经进行了广泛的研究，特别是与颗粒大小相关的生物途径（Champion等人，2007；Finbloom等人，2020；He等人，2010；Tan等人，2013）。根据文献，大于200纳米的纳米颗粒通常会被脾脏过滤掉，而小于100纳米的颗粒可以通过内皮细胞的缝隙进入血液（Hoshyar等人，2016；Wang等人，2013）。如前所述，许多研究人员开发了100–200纳米范围内的纳米药物递送载体，以利用增强的渗透性和滞留效应（EPR）实现被动靶向（Mohammadzadeh等人，2022；Wu，2021）。纳米药物递送载体设计的另一个关键因素是纳米颗粒的表面电荷。表面电荷可以受到药物递送载体上存在的官能团的影响，并通过适当选择前体材料或进行表面修饰来调节（Atrei等人，2022；Kim等人，2018；Na等人，2019）。关于纳米颗粒表面电荷的影响的研究有限（Fromen等人，2016；He等人，2010；Xiao等人，2011）。然而，大多数这些研究使用荧光素染料作为追踪剂，并主要集中在体外研究上。
考虑到使用放射性同位素（RI）对LDH进行牢固标记的优势，本研究重点关注基于其表面电荷和给药途径的LDH纳米颗粒的生物途径，通过PET进行评估。对于LDH的放射性标记，采用了同质取代反应，将放射性同位素（^55Co；Co-55）直接掺入LDH框架中，以确保标记的牢固性和稳定性。原始LDH是通过使用二价镁（Mg^2+）和三价铝（Al^3+）离子以及层间阴离子碳酸根离子（CO?^2?）的传统共沉淀法合成的。为了改变表面电荷，使用三钠柠檬酸根生成负电荷的LDH，而使用二钠琥珀酸根生成中等正电荷的LDH。合成的原始LDH和表面修饰后的LDH通过粉末X射线衍射（PXRD）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、扫描电子显微镜（SEM）、ζ电位和动态光散射（DLS）进行了全面表征。三种表面电荷控制的LDH变体被^55Co RI标记，并在效率、稳定性、体外细胞摄取和不同给药途径下的体内PET成像方面进行了评估（图1）。
材料
用于制备LDH的试剂级六水合氯化镁（MgCl?·6H?O，≥99.0%）、六水合氯化铝（AlCl?·6H?O，99%）、氢氧化钠（NaOH，≥97.0%）和碳酸氢钠（NaHCO?，≥99.7%）从Sigma-Aldrich Co. LLC（美国密苏里州圣路易斯）购买。为了改变LDH的表面电荷，还从Sigma-Aldrich Co. LLC购买了三钠柠檬酸二水合物（≥99.0%）和琥珀酸二钠盐（99%）。所有化学品均用于实验。
表面修饰前后LDH的表征
原始LDH和表面修饰后的LDH（LDH-Cit和LDH-Suc）的晶体结构通过PXRD进行分析。如图1所示，原始LDH在11.14°和23.28°处显示出明显的（00l）衍射峰，分别对应于（003）和（006）平面。此外，在34.65°、38.71°、46.02°、60.95°和62.09°处还检测到典型的晶格衍射峰（012）、（015）、（018）、（110）和（113），这与典型的水滑石结构一致（JCPDS编号）。
结论
通过传统的共沉淀方法成功合成了表面电荷可控的LDH纳米颗粒，随后通过柠檬酸根和琥珀酸根进行了简单的表面修饰。表面修饰没有改变LDH颗粒的晶体结构或形态。然而，LDH-Cit和LDH-Suc的表面电荷分别转变为负电荷和中等正电荷区域。为了牢固地标记放射性同位素，直接使用了Co-55。
CRediT作者贡献声明
金泰贤（Tae-Hyun Kim）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学，研究，数据分析，概念化。李俊英（Jun Young Lee）：撰写 – 原稿，可视化，研究，数据分析。黄仁珠（Injoo Hwang）：可视化，研究，数据分析。朴正勋（Jeong Hoon Park）：撰写 – 审稿与编辑，监督，资源管理，项目协调，资金获取，概念化。
利益冲突声明
朴正勋报告称获得了韩国国家研究基金会的财政支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家科学技术信息服务（NTIS 2710007333）和韩国国家研究基金会（NRF）的资助，该基金会由韩国政府（MSIT）提供支持（RS-2023-00210260）。我们还要感谢韩国原子能研究所（Jeongeup，韩国）的RFT-30回旋加速器设施的研究人员对^55放射性同位素生产所做的贡献。
