《Microbiology Spectrum》：Evaluation of an automated blood culture detection system for sterility testing of cellular and gene therapy products
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本研究报告针对细胞与基因治疗（Cellular and Gene Therapy, CGT）产品在临床前无菌检测中存在的潜在问题——特别是不同细胞制剂配方（如含DMSO的冷冻保护液）可能抑制微生物生长导致假阴性结果——进行了深入评估。研究团队通过使用BacT/Alert Virtuo自动化血培养系统，对两种标准CGT产品配方（Plasmalyte-A + 2.5% HSA 和 Plasmalyte-A + 5% HSA + 5% DMSO）进行了微生物（包括细菌、酵母菌和霉菌）回收能力的系统性测试。研究结果表明，该自动化系统能在72小时内正确检出所有模拟污染样本，两种制剂均未显示出对微生物回收的抑制作用，从而证明了自动化血培养系统作为USP <71>药典标准方法可靠替代方案的可行性。该研究为CGT产品的快速、准确无菌放行提供了重要实验依据，对保障患者用药安全、优化实验室工作流程及应对当前CGT产品快速增长的需求具有显著意义。
在当今生物医药领域，细胞与基因治疗（Cellular and Gene Therapy, CGT）产品，例如用于治疗血液肿瘤的嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor T-Cell, CAR-T）疗法，正以前所未有的速度改变着临床治疗格局。随着越来越多的CGT产品获得监管机构（如美国FDA）的批准，确保这些“活”的治疗产品在输注给患者前的绝对无菌性，成为了保障治疗安全、避免灾难性感染后果的重中之重。传统的无菌检测遵循药典标准（如USP <71>方法），通常需要将样品直接接种到液体培养基（如大豆酪蛋白消化肉汤和巯基乙酸酯肉汤）中，并肉眼观察14天。这种方法虽然经典，但耗时较长，且高度依赖人工操作，在当今追求快速放行以治疗重症患者、且实验室人力资源紧张的背景下，其局限性日益凸显。
与此同时，自动化血培养检测系统（如BacT/Alert Virtuo）因其能够提供连续、自动化的微生物生长监测，并显著减少人为干预和污染风险，在临床微生物实验室中已广泛应用。然而，一个悬而未决的关键问题是：CGT产品通常需要在特殊配方的溶液中悬浮、冷冻保存，例如含有二甲亚砜（Dimethyl Sulfoxide, DMSO）和人血清白蛋白（Human Serum Albumin, HSA）的冷冻保护液。这些配方成分理论上可能抑制污染微生物的生长，导致在无菌检测中出现假阴性结果，从而将受污染的危险产品误判为“无菌”并输注给患者。这种潜在风险，加之CGT产品配方本身也在不断演进，使得评估不同配方对现有检测方法的影响变得至关重要。
基于以上背景，由美国凯斯西储大学/大学医院克利夫兰医学中心的研究人员领衔的团队，在《微生物学谱》（Microbiology Spectrum）杂志上发表了一项研究，旨在系统评估自动化血培养检测系统在两种标准CGT产品配方中进行无菌检测的可靠性和准确性。他们想知道：这些配方是否会干扰微生物的检测？自动化系统能否快速、灵敏地检出包括霉菌在内的多种微生物？研究结果有力地支持了自动化系统的应用前景。
为了回答上述问题，研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：首先，他们使用了BacT/Alert Virtuo全自动血培养系统及其配套的需氧（FA Plus）和厌氧（FN Plus）血培养瓶作为核心检测平台。其次，研究设计了模拟污染样本，将六种代表性微生物（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、产孢梭菌、白色念珠菌和巴西曲霉）接种到两种待测CGT配方（Plasmalyte-A + 2.5% HSA 和 Plasmalyte-A + 5% HSA + 5% DMSO）及生理盐水对照中。第三，对培养瓶报阳后的样本，他们采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS） 对细菌和酵母进行鉴定，而对丝状真菌则采用宏观和微观形态学观察进行鉴定。最后，研究还纳入了对本机构2016年1月1日至2025年6月30日期间共1667例CGT产品无菌检测结果的回顾性分析，以了解实际临床样本的阳性率和常见污染菌谱。
研究结果
通用性能表现
研究显示，BacT/Alert Virtuo系统在72小时内正确报阳了所有18组模拟污染的血培养瓶组。从首瓶报阳的中位时间来看，生理盐水对照组为14小时9分钟，而两种CGT配方组分别为13小时21分钟和13小时46分钟，统计学上无显著差异。这表明，两种被测试的标准CGT产品配方（包括含有5% DMSO的配方）均未对测试的六种微生物的回收和检测时间产生抑制作用。
微生物特异性表现
不同微生物的检测时间存在差异，但均被成功检出。需注意，某些微生物因其生长偏好性，仅在特定类型的培养瓶中生长良好。例如，专性厌氧菌产孢梭菌仅在厌氧瓶中生长；而严格需氧菌巴西曲霉则仅在需氧瓶中检测到。白色念珠菌在部分厌氧瓶中生长延迟，有两瓶甚至超过了USP <71>规定的5天检出标准，但其对应的需氧瓶均符合标准。这些结果凸显了在无菌检测中同时使用需氧和厌氧瓶的必要性，以确保覆盖所有类型的微生物。
霉菌检测的优化
研究中遇到的一大挑战是霉菌（巴西曲霉）的早期鉴定。尽管所有接种了巴西曲霉的需氧瓶都在自动化系统上报阳，但其初始革兰染色均未观察到霉菌。通过在革兰染色阴性时增加钙荧光白（Calcofluor White）荧光染色，以及常规传种至沙氏葡萄糖琼脂（Sabouraud Dextrose Agar, SDA）平板，显著提高了早期霉菌的检出率。研究建议，鉴于细胞治疗产品无菌检测阳性率低，实验室应考虑对所有报阳但革兰染色阴性的样本，常规进行钙荧光白染色和SDA平板传种，以优化霉菌检测流程。
环境污染物检测
一个意外但极具启发性的发现是，在生理盐水对照组的产孢梭菌和白色念珠菌样本中，额外检出了罗尔斯通菌属（Ralstoniaspp.） 的污染，并且在巴西曲霉的盐水对照组中，检出的也是罗尔斯通菌而非预期目标。后续调查证实污染源是盐水储备瓶本身。这一发现不仅展示了所采用的检测方法具有检出意外污染的能力，也强调了在实验中使用新鲜、无菌盐水**的重要性。
回顾性分析
对过去8年多的临床数据进行回顾发现，在1667次无菌检测中，总体阳性率仅为2.2%。最常见的污染物是皮肤共生菌，如痤疮皮肤杆菌（Cutibacterium acnes， 原名Propionibacterium acnes） 和表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）。值得注意的是，痤疮皮肤杆菌和糖发酵葡萄球菌（S. saccharolyticus）均仅从厌氧瓶中回收，这再次印证了使用厌氧瓶对检出某些特定微生物的关键作用。在研究期间，未从任何样本中分离出霉菌。
结论与讨论
本研究的核心结论是，使用BacT/Alert Virtuo自动化血培养系统对两种标准的细胞与基因治疗产品配方（含或不含DMSO）进行无菌检测，未观察到配方对微生物回收的抑制作用，系统能够可靠、快速地（均在72小时内）检出包括细菌、酵母和霉菌在内的多种代表性微生物。这为自动化血培养系统作为USP <71>药典标准方法的可靠替代方案，用于CGT产品的无菌检测提供了有力证据。
研究的重要意义体现在多个层面。首先，在临床实践上，自动化系统可显著缩短检测周转时间。考虑到所有模拟污染样本均在72小时内被检出，未来或有理由考虑将孵育期从标准的14天缩短至4-7天，从而加速产品放行，这对于治疗危重患者和应对CGT产品短保质期至关重要。其次，在操作流程上，自动化系统实现了连续监测和最少化人工操作，这不仅减轻了实验室人员负担，也最大程度降低了检测过程中引入环境污染的风险。再次，在方法学上，研究明确了联合使用需氧和厌氧瓶对于覆盖不同生长需求的微生物（如专性厌氧菌和严格需氧菌）是不可或缺的。同时，研究提出的优化流程（针对报阳但革兰染色阴性的样本，增加钙荧光白染色和SDA平板传种） 为解决自动化系统中霉菌早期检出的难题提供了实用方案。
此外，回顾性数据分析揭示了CGT产品无菌检测中常见的污染物是皮肤共生菌，提示采样或处理过程是污染的主要环节。研究中意外检出的罗尔斯通菌污染事件，也反向证明了该检测体系的灵敏度，并警示了实验试剂（如盐水）质量控制的重要性。
当然，研究也存在一定局限性，例如测试的微生物种类和配方有限，且仅在单一机构进行。某些对培养条件要求苛刻的微生物（如分枝杆菌、支原体等）的检出能力仍需进一步评估。将阳性样本检测流程整合到常规临床实验室工作中也可能面临挑战。
总而言之，这项研究支持将自动化血培养检测系统作为一种可靠的无菌检测替代方法，用于不同配方的细胞与基因治疗产品。尽管将该方法纳入常规工作流程需根据各实验室的资源、人员和专业知识而定，但与传统的USP <71>方法相比，自动化系统在速度、自动化程度和降低污染风险方面展现出明显优势，为保障日益增长的CGT产品安全、高效地应用于临床提供了重要的技术依据。
