《Bioactive Materials》：A composite hydrogel enables the spatiotemporal delivery of distinct cytokines to drive the native vascularized bone regeneration
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骨缺损是骨科常见临床难题，成功治疗的关键在于实现早期血管化与后期成骨分化协同调控。为解决单一生长因子递送系统难以模拟体内细胞因子时空作用动态的挑战，研究人员构建了一种负载PCSK9和VEGF的复合水凝胶(GelMA-VEGF/ECM-PCSK9)。该体系利用材料不同的缓释特性，成功实现了加速早期血管化和增强后期成骨分化的耦合调控，为临床骨缺损修复提供了新的治疗靶点和创新策略。
骨，作为我们身体的“钢筋混凝土”，一旦因创伤、感染或肿瘤造成大块缺损，其自我修复能力便显得力不从心。骨缺损是骨科临床的常见难题，而成功修复的“金标准”在于实现“兵马未动，粮草先行”——即在早期快速建立丰富的血管网络，为后续骨组织生长运送氧气和营养，同时在后期高效地促进干细胞分化为成骨细胞，沉积骨基质。然而，这两个关键过程在时间和空间上紧密偶联、有序进行，传统的单一生长因子“一次性”递送策略，难以复现这种精妙的生理节律。能否设计一种“智能”材料，像交响乐指挥一样，精准调控不同生长因子的释放“乐章”，从而驱动符合自然愈合过程的血管化骨再生？这成为了骨组织工程领域亟待攻克的一座堡垒。
近期，由Zhou Chengwei、Bai Jinwu、Zhu Jianhua等人组成的研究团队在《Bioactive Materials》上发表的研究，为我们提供了一种富有前景的解决方案。他们巧妙地将两种具有不同释放动力学的生物材料——甲基丙烯酰化明胶(GelMA)和血管来源的细胞外基质(ECM)——组合在一起，构建了一种名为GelMA-VEGF/ECM-PCSK9的复合水凝胶。这个体系如同一个“双腔室药物储库”：将促血管生成的关键因子血管内皮生长因子(VEGF)装载入降解较快的GelMA“快释腔”，用于早期快速启动血管新生；同时，将新发现的促骨生成因子前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)吸附于降解缓慢的ECM“缓释腔”，用于后期持续促进成骨分化。通过这种设计，该水凝胶系统旨在模拟天然骨缺损愈合的时空进程，实现血管生成与成骨作用的耦合调控。
为开展此项研究，研究人员综合运用了多项关键技术方法。首先，他们从绵羊主动脉制备了去细胞化的血管ECM，并通过扫描电镜、DNA及脂质残留检测等手段验证了其去细胞效果和结构完整性。其次，通过物理吸附将PCSK9负载于ECM，并通过光交联技术将负载VEGF的GelMA与负载PCSK9的ECM复合，构建了复合水凝胶体系，并系统表征了其微观结构、溶胀率、降解行为以及VEGF和PCSK9的体外释放动力学。在细胞学层面，研究使用了人骨髓间充质干细胞(BMMSC)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，通过CCK-8、活死染色、碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红(ARS)染色、qRT-PCR、Western blot、免疫荧光、成管实验和细胞迁移实验等，评估了材料的生物相容性及其对血管生成和成骨分化的影响。在动物实验层面，研究建立了大鼠颅骨临界尺寸骨缺损模型，将不同组分的水凝胶植入缺损处，8周后通过Micro-CT扫描、组织学染色(HE、Masson、番红O)及组织免疫荧光染色(CD31、VEGF、COL1A1、RUNX2)来评估体内骨再生与血管生成的效果。
研究结果揭示了以下重要发现：
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PCSK9在骨再生中表达上调并促进成骨：研究人员发现，在大鼠骨组织再生过程中，PCSK9的表达水平逐渐上调。体外实验证实，补充外源性PCSK9可以增强BMMSC的成骨分化能力，显著上调成骨相关基因(如RUNX2、COL1A1)和蛋白的表达，并提高ALP活性和钙结节形成。机制研究表明，PCSK9通过激活细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路来发挥促骨生成作用。
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复合水凝胶成功构建并具备时空释放特性：成功制备了去细胞化血管ECM，其保留了完整的三维结构，且能高效吸附PCSK9(负载效率>50%)。复合水凝胶呈现高度多孔的3D结构。关键的释放动力学实验显示，无论从纯GelMA还是GelMA-ECM复合水凝胶中，VEGF均在约两周内完全释放；而PCSK9从ECM及GelMA-ECM中的释放则更为缓慢持久，在约26天完全释放，表明该体系能实现VEGF的早释和PCSK9的缓释。体内荧光成像也证实GelMA水凝胶约在一个月内完全降解，与早期血管生成阶段的时间窗吻合。
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复合水凝胶具有良好的生物相容性与协同增效作用：ECM、GelMA及其复合水凝胶均显示出良好的生物相容性，对BMMSC和HUVEC的活力和增殖无显著不良影响。体外功能实验表明，与单一因子组相比，含有VEGF和ECM的复合水凝胶(GV, GVE, GVEP)能显著增强HUVEC的迁移和成管能力。在成骨方面，负载PCSK9的复合水凝胶(EP, GVEP)能显著促进BMMSC的成骨分化，其中同时包含VEGF和PCSK9的GVEP组表现出最强的促成骨效应。
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复合水凝胶在大鼠骨缺损模型中显著促进血管化骨再生：Micro-CT定量分析和三维重建显示，植入GVEP复合水凝胶的大鼠颅骨缺损区域，在8周后骨再生效果最佳，骨体积分数(BV/TV)等参数显著优于其他对照组。组织学染色结果进一步证实，GVEP组新生骨组织最多，胶原纤维沉积最丰富。组织免疫荧光分析表明，GVEP组缺损区域的血管生成标记物(CD31, VEGF)和成骨标记物(COL1A1, RUNX2)的表达水平也均为最高，直观证明了该水凝胶在体内同步促进了血管新生和骨形成。
结论与讨论：本研究成功构建了一种基于GelMA/ECM的复合水凝胶双因子递送系统。该系统的创新性在于，它并非简单地将两种生长因子混合，而是巧妙地利用了GelMA较快降解和ECM缓慢降解并具有高效吸附能力的特性，实现了促血管因子VEGF的早期快速释放和促骨因子PCSK9的后期持续释放。这种差异化的时空释放谱，精准地模拟了天然骨愈合过程中先建立血运、后形成硬骨的自然序列，从而实现了血管生成与成骨过程的“耦合调控”。体内外实验结果一致证实，该复合水凝胶能有效协同增强早期血管化和后期成骨分化，在大鼠临界尺寸骨缺损模型中取得了显著的修复效果。机制上，研究首次揭示并验证了PCSK9通过激活ERK信号通路促进BMMSC成骨分化的新机制。
这项研究的重要意义在于，它不仅仅是为骨缺损治疗提供了一种新型的生物材料，更重要的是提出了一种“仿生时序递送”的设计理念。它解决了传统生长因子递送技术中时空控制不足的痛点，为复杂组织再生过程中多信号协同调控提供了可借鉴的策略。此外，该研究将原本在脂代谢领域备受关注的PCSK9拓展到骨代谢与再生医学领域，为其开辟了新的应用场景。该复合水凝胶所用组分均源于天然材料，具有良好的生物安全性，因此，这项成果不仅为骨组织工程和再生医学提供了新的思路和材料选择，也为临床开发更安全、高效的骨缺损修复疗法奠定了坚实的实验基础。
