骨髓间充质干细胞衍生的外泌体通过SIRT6调节HMGB1的乙酰化作用，从而改善椎间盘退变

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes ameliorate intervertebral disc degeneration by regulating HMGB1 acetylation via SIRT6

本研究探讨骨髓间充质干细胞外泌体（BMSC-exos）通过SIRT6介导的HMGB1去乙酰化抑制炎症的作用机制，并验证其在椎间盘退行性病变（IVDD）治疗中的疗效。实验表明，BMSC-exos上调SIRT6表达，促进HMGB1去乙酰化，抑制TLR4/NF-κB信号通路，减少NP细胞凋亡，有效缓解IVDD炎症和病变进展。

　　

王洪申|文勇|梅老奇|李新毅|林永鹏|肖志峰|李永进|张玉毅|陈伯来

中国广东省广州市广州中医药大学第二附属医院，邮编510120

摘要

背景

椎间盘退变（IVDD）是导致腰痛和腿痛的主要原因，其主要机制是髓核（NP）细胞因炎症而发生凋亡。骨髓间充质干细胞衍生的外泌体（BMSC-exos）在退行性疾病治疗中显示出强大的潜力。Sirtuin 6（SIRT6）是一种关键的衰老和炎症调节因子，与IVDD的进展密切相关。因此，我们假设BMSC-exos可能通过促进SIRT6介导的高迁移率族box 1（HMGB1）的去乙酰化来抑制炎症，从而缓解IVDD。

方法

在本研究中，我们从BMSCs中分离出BMSC-exos，并使用透射电子显微镜（TEM）、纳米粒子追踪分析（NTA）和Western blot分析对其进行了表征。我们通过Cell Counting Kit-8（CCK-8）实验、逆转录-定量聚合酶链反应、Western blotting、ELISA和免疫荧光分析，研究了BMSC-exos调节SIRT6/HMGB1/Toll样受体4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）信号通路的机制。我们还通过苏木精-伊红（H&E）染色、ELISA、免疫荧光染色和TUNEL实验评估了BMSC-exos在体内的治疗效果。

结果

BMSC-exos上调了SIRT6的表达，促进了HMGB1的去乙酰化，并阻止了HMGB1从细胞核转移到细胞质中，从而抑制了HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路的激活，减轻了IVDD引起的炎症，并在体外保护了NP细胞。此外，BMSC-exos还抑制了炎症反应，减少了NP细胞的凋亡，并在体内减缓了IVDD的进展。

结论

据我们所知，本研究首次证明了BMSC-exos通过调节SIRT6/HMGB1/TLR4/NF-κB通路来抑制炎症，从而减缓了IVDD的进展。

引言

椎间盘退变（IVDD）是一种常见的退行性疾病，是脊柱退行性病变的主要诱因（1），（2）。该疾病的主要症状包括腰痛、腿痛、麻木和活动能力下降。随着人口老龄化，IVDD相关的腰痛和腿痛的发病率和患病率持续上升（3）。目前，手术切除退化的髓核（NP）和椎体融合术被广泛采用（4），（5），同时也开发出了新的生物疗法（6），（7）。然而，治疗效果仍不令人满意，且可能增加相邻节段退化的风险（8）。因此，深入理解IVDD的发病机制并探索有效的治疗策略至关重要，这对IVDD的管理具有重要的临床意义。

间充质干细胞（MSCs）是一种具有自我更新和分化为多种类型细胞能力的多能干细胞。它们具有丰富的来源和低免疫原性等特性（9）。过去几十年来，越来越多的研究表明，骨髓来源的MSCs（BMSCs）在髓核（NP）再生和椎间盘修复中起着关键作用（10），（11）。外泌体是一种直径在40到200纳米之间的小囊泡，具有双层膜结构，已成为细胞间通讯的重要介质（12）。传统的细胞外囊泡分析方法往往无法区分不同大小的囊泡亚类。相比之下，基于表面等离子共振显微镜的自动化数字囊泡分析仪以及用于肿瘤来源外泌体的微流控分子分析技术为研究和临床应用细胞外囊泡提供了新的方法（13），（14）。最近的研究表明，来自MSCs的外泌体不仅克服了MSCs在恶劣环境中的生存、增殖和分化难题，还表现出与MSCs相似的功能特性，例如修复受损组织、抑制炎症和调节免疫反应（15），（16）。现有研究表明，来自BMSCs的外泌体（BMSC-exos）可以通过抑制NP细胞中的炎症和凋亡来减缓IVDD的进展（17），（18），（19）。然而，BMSC-exos在IVDD中发挥作用的精确机制尚未完全明了。

高迁移率族box 1蛋白（HMGB1）是一种存在于真核细胞中的非组蛋白蛋白，能够与Toll样受体结合并调节多种炎症因子的释放（20）。最近的研究表明，HMGB1与多种炎症性疾病（包括IVDD（21）、自身免疫性疾病（22）和骨关节炎（23）的发生和发展密切相关。因此，有人假设HMGB1的细胞外释放可能涉及Sirtuin蛋白介导的乙酰化过程。Sirtuin 6（SIRT6）属于III类NAD⁺依赖性HDAC蛋白家族，参与调节与炎症、DNA修复、端粒酶功能、基因组稳定性和能量代谢相关的基因的脱乙酰化过程（24），（25）。尽管有证据表明SIRT6参与了HMGB1的乙酰化和转运（26），（27），但关于SIRT6在IVDD中的具体作用仍知之甚少。

本研究的目的是探讨BMSC-exos对SIRT6和HMGB1相互作用的影响、炎症的缓解作用、NP细胞的保护作用以及IVDD的减缓效果。本研究旨在为IVDD的干细胞治疗提供新的见解。

细胞与细胞培养

小鼠BMSCs和NP细胞来自Procell生命科学技术有限公司（CP-M131, CP-M146，武汉，中国）。BMSCs和NP细胞在含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的完全DMEM培养基中培养，培养温度为37?C，培养环境为5% CO₂。为了建立NP细胞的体外模型，在培养基中添加了最终浓度为200 μΜ的H₂O₂（28）。

BMSC-exos的提取与分离

为了获得BMSC-exos，采用了超速离心法。

BMSC-exos的分离与表征

在培养扩增后，BMSCs呈现出典型的纺锤形形态（图S1A）。此外，通过流式细胞术分析了表面抗原的表达情况，以表征分离出的细胞。结果表明，骨髓来源的细胞高表达CD73和CD90，而CD45和CD34的表达较少（图S1B–E），这证实了BMSCs的特性。我们使用TEM、NTA和Western blot方法分离和表征了BMSC-exos。

讨论

IVDD仍然是腰痛的常见原因（20）。大量研究表明，炎症是IVDD发病机制的核心（48），（49）。BMSCs是具有免疫调节特性的多能干细胞，在调节免疫反应和炎症中起着关键作用（50）。过去十年中，越来越多的证据表明BMSC衍生的外泌体在IVDD治疗中具有潜力（51），（52）。H₂O₂常被用于诱导细胞衰老

患者发表同意书

不适用

CRediT作者贡献声明

李新毅：数据验证、软件处理。林永鹏：数据验证、软件处理。肖志峰：软件处理、方法学设计、资金获取。李永进：数据验证、软件处理、资金获取。张玉毅：数据验证、软件处理。陈伯来：撰写、审稿与编辑、项目管理、资金获取。王洪申：初稿撰写、方法学设计、资金获取。文勇：数据验证、软件处理。梅老奇：数据验证、软件处理

数据和材料的获取

如需获取数据和材料，请联系通讯作者。

伦理审批与参与同意

所有实验均获得了广东省中医药医院实验动物伦理审查委员会的批准（批准编号：2021039）。

利益冲突

作者们声明没有利益冲突。

资助

本研究得到了以下机构的支持：中国博士后科学基金会资助的项目（项目编号：2021M690758，资助对象：HSW），广东省中医药医院的科学研究项目（项目编号：YN2020QN14，资助对象：HSW），广州市科技计划项目（项目编号：202201020554，资助对象：HSW；项目编号：202201020324，资助对象：YJL），广东省教育厅的创新团队项目（项目编号：2021KCXTD020，资助对象：CBL），以及国家自然科学基金（项目编号：82104894，资助对象：ZFX；项目编号：82274554，资助对象：……）

利益冲突声明

作者之间不存在利益冲突。

致谢

无