阿尔茨海默病研究中，用于RT-qPCR分析的血浆星形胶质细胞来源外泌体mRNA中稳定参考基因的鉴定

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Identification of stable reference genes in plasma astrocyte-derived exosomal mRNA for RT-qPCR analysis in Alzheimer's disease

【字体：大中小】 时间：2026年03月21日 来源：Biochemical and Biophysical Research Communications 2.2

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　　阿尔茨海默病（AD）早期诊断依赖稳定参考基因用于RT-qPCR数据校正。研究通过Genorm、Bestkeeper等五算法评估血浆ADEs中候选参考基因稳定性，发现YWHAE和RNPS1在CU、MCI、AD组中表达稳定，优于传统GAPDH，为ADEs mRNA诊断提供标准化方法。

郭贵贵|曲一文|王启瑶|肖志华|刘秦|曾贤锋|陈守文

生物反应器工程国家重点实验室，上海光遗传技术细胞代谢前沿科学中心，华东科技大学，上海200237，中国

摘要

通过RT-qPCR准确量化相对基因表达需要选择合适的参考基因来进行数据标准化。最近，细胞外囊泡成分，特别是外泌体RNA，已成为阿尔茨海默病（AD）的有希望的生物标志物。在这些成分中，来自星形胶质细胞来源的外泌体（ADEs）的mRNA由于其在体内的高稳定性和穿越血脑屏障的能力，在AD诊断和预后中具有特殊意义，从而能够真实反映AD患者的脑部病理变化。然而，尚未系统地确定用于标准化ADEs中目标基因表达的合适参考基因。在这项研究中，我们使用五种稳健的算法（包括Genorm、Bestkeeper、ΔCt方法、Normfinder和RefFinder）全面评估了认知未受损（CU）、轻度认知障碍（MCI）和AD患者血浆ADEs中候选参考基因的表达稳定性。我们的结果显示，YWHAE和RNPS1在所有三组中表现出优越的表达稳定性，而常用的参考基因GAPDH则稳定性不足。总体而言，我们的工作首次系统地验证了用于血浆ADEs中mRNA量化的参考基因，为基于ADE的AD生物标志物开发奠定了方法论基础。

引言

阿尔茨海默病（AD）仍然是全球神经退行性疾病的领先原因，其致病机制尚未完全明确[1]。临床诊断通常在出现显著记忆障碍和不可逆的神经元损失之后才进行[2]。因此，早期检测对于及时干预以延缓疾病进展或预防发病至关重要[3]。虽然传统的诊断方法，如磁共振成像（MRI）、正电子发射断层扫描（PET）和脑脊液（CSF）生物标志物，效果显著[4]、[5]，但它们存在显著局限性。神经成像成本高昂且不易获取，而CSF分析需要侵入性的腰椎穿刺，这限制了其在大规模筛查和纵向监测中的应用[6]。因此，迫切需要基于血液的微创生物标志物。尽管血脑屏障（BBB）限制了中枢神经系统特异性分子向外周的释放[7]、[8]，但脑来源的细胞外囊泡（EVs），特别是外泌体，可以穿越BBB。这些囊泡将疾病特异性的分子特征带入循环系统，从而通过外周血样本提供对脑部病理的窗口。

外泌体是生物活性纳米载体，包裹着蛋白质、RNA和脂质，介导细胞间通信并反映其母细胞的生理状态[9]、[10]、[11]。在AD的背景下，神经元来源的外泌体（NDEs）已被广泛研究。它们有助于监测神经元蛋白质、miRNA和胰岛素信号通路，作为神经退行性的替代标志物。例如，富含磷酸化tau 181（p-tau181）和淀粉样蛋白Beta（1-42）（Aβ1-42）的血浆NDEs已被证明可以在临床诊断前十年预测AD的发病[12]。同样，下一代测序技术在AD患者的外泌体中发现了独特的tRNA衍生片段特征[13]。然而，尽管非神经元细胞在神经炎症和突触维持中起着关键作用，但对来自胶质细胞（特别是星形胶质细胞和少突胶质细胞）的血浆外泌体的研究仍然相对较少。

重要的是，反应性星形胶质增生是AD发病机制的早期事件。来自星形胶质细胞的外泌体（ADEs）在传播神经病理学变化中起着关键作用，它们能够运输诸如Aβ、β-分泌酶1（BACE-1）和p-tau等致病聚集体。在AD患者的血浆ADEs中检测到BACE-1、可溶性淀粉样前体蛋白beta（sAPPβ）和补体蛋白的水平升高，突显了它们的诊断潜力[14]、[15]。此外，特定的miRNA（如miR-107）在轻度认知障碍（MCI）患者的ADEs中表现出差异表达，与皮质萎缩相关，而在NDEs中则无法检测到这种相关性[16]。这表明ADEs可能为早期疾病进展提供独特的、细胞类型特异性的见解。尽管已经探索了ADEs的蛋白质组和miRNA谱，但它们的mRNA cargo仍然是一个未探索的领域。

鉴于外泌体脂质双层对RN酶降解具有抵抗力，来自ADE的mRNA在开发基于RNA的诊断工具方面具有巨大潜力。实时定量PCR是基因表达分析的首选方法[17]、[18]、[19]，但其准确性严重依赖于使用稳定参考基因进行适当标准化[20]、[21]。尽管小核核糖核蛋白多肽G（SNRPG）和外膜转运蛋白7（TOMM7）等基因已被提出作为一般EVs的参考标准[22]，但我们的初步转录组数据表明它们在ADE亚群中缺乏稳定性。为了解决这一方法学空白，我们筛选了五个候选参考基因，并评估了它们在来自认知未受损（CU）、MCI患者和AD患者的血浆ADEs中的稳定性。通过五种统计算法（包括Genorm[23]、Normfinder[24]、Bestkeeper[25]、ΔCt[26]和RefFinder[27]）确定了最佳参考基因组合。本研究建立了一个稳健的分析框架，用于准确量化来自ADE的mRNA，有助于未来发现新的AD诊断生物标志物。

研究人群和血液收集与处理

本研究招募了20名认知未受损（CU）个体（平均年龄72.8 ± 7.54岁）、20名轻度认知障碍（MCI）患者（平均年龄64.4 ± 12.08岁）和20名AD患者（平均年龄67.7 ± 10.54岁）的血浆样本。本研究遵循赫尔辛基宣言进行，并获得了瑞金医院的批准（方案代码：2022-254）。在获得所有参与者的知情同意后进行了血液收集。人口统计和临床特征总结在表1中。

从血浆中分离出的ADEs的表征和鉴定

使用已建立的方法从CU对照组和AD患者的总血浆EVs中成功富集ADEs后（图1A和1B），TEM确认了它们的特征性外泌体形态（图1C）。一致地，NTA显示CU组和AD组的外泌体峰值粒径分别为82 nm和106 nm，平均粒浓度分别为8.83×10^10粒子/mL（CU）和9.25×10^10粒子/mL（AD）（图1B-1D）。值得注意的是，分离出的ADEs的粒子浓度

讨论

RNA被封装在脂质双层中，保护这些 cargo免受RN酶降解，使外泌体谱成为与疾病状态相关的生化变化的稳定代理[32]、[33]。然而，我们目前的理解在临床应用方面存在显著差异。虽然外泌体mRNA特征在肿瘤学中得到了严格验证，例如WASF2和MAGEA3的有效性[34]、[35]，但在神经退行性疾病中的研究仍然相对较少

结论

为了解决分析血浆来源ADEs的方法学不一致性问题，本研究通过系统筛选确定了一个包含YWHAE和RNPS1的稳健参考基因组。通过验证这些候选基因在认知未受损对照组、MCI和AD患者中的表达稳定性，我们为量化ADE来源的cargo提供了一个必要的标准化框架。该组件的验证有助于减少下游技术变异性

伦理声明

本研究遵循赫尔辛基宣言进行，并获得了瑞金医院的批准（方案代码：2022-254）。

CRediT作者贡献声明

郭贵贵：写作——审阅与编辑，撰写——初稿，可视化，验证，方法学，调查，正式分析，数据管理。陈守文：写作——审阅与编辑，监督，方法学，概念化。刘秦：写作——审阅与编辑，监督，概念化。曾贤锋：写作——审阅与编辑，监督。王启瑶：写作——审阅与编辑，监督。肖志华：写作——审阅与编辑，监督，资金获取。曲一文：