针对IAV M2蛋白保守结构域的虚拟筛选显示，ajmaline具有潜在的广谱抗IAV活性

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Virtual screening targeting the conserved domain of the IAV M2 protein reveals the potential broad-spectrum anti-IAV activity of ajmaline

抗流感药物阿吉玛林通过靶向M2蛋白跨膜域抑制病毒复制并激活干扰素通路，克服耐药性并广谱有效。分子模拟和细胞实验验证其与野生型和N31S突变体M2蛋白结合，体内实验显示83%存活率。保守域靶向策略为抗流感药物研发提供新思路。

　　

陈敏|陈文焕|蒋欣怡|梁少梅|秦英桥|唐佳怡|李一飞|吴启帆|梁雪|魏鹏程|刘坤鹏|罗素兰

中国广西大学医学院特殊生物医学重点实验室，南宁

摘要

甲型流感病毒（IAV）通过抗原变异迅速进化，导致耐药性和大流行潜力。为了规避突变逃逸，我们采用了一种药物再利用策略，针对IAV M2蛋白中进化保守的跨膜结构域（TMD）。在这里，我们报告了一种抗心律失常生物碱Ajmaline的发现，它通过针对M2蛋白保守的跨膜结构域进行虚拟筛选，被证明是一种广谱抗IAV剂。分子对接和100纳秒动力学模拟显示其在多种IAV亚型（H1N1、H2N2、H5N1、H7N9）中具有稳定的结合能力。细胞热位移测定证实了其与野生型和N31S突变型M2蛋白的直接结合。Ajmaline通过双重机制表现出强抗病毒活性：直接抑制病毒复制和上调干扰素相关基因（IFN-β、ISG56），同时抑制细胞凋亡（下调Bax）。在体内实验中，Ajmaline（15毫克/千克）使H1N1感染小鼠的存活率提高了83%，减少了肺部病毒载量，并减轻了肺部病理变化。这些发现表明Ajmaline是一种能够克服现有耐药性的再利用广谱抗病毒候选药物，为针对保守结构域的抗病毒药物开发策略提供了概念验证。

引言

甲型流感病毒（IAV）每年都会引发流行病，并周期性地导致大规模疫情，造成大量发病率和死亡率[1]、[2]。1918年的H1N1大流行导致全球约5000万人死亡[3]，[4]，随后在1957年、1968年和2009年的大流行进一步凸显了这一持续的威胁[5]。IAV的高突变率由易出错的RNA复制和基因重组驱动，使其能够快速进化抗原，从而逃避免疫识别。这些病毒株具有不同的传播性、致病性和大流行潜力，使得疫苗和抗病毒药物在几个月到几年内就失效[6]。H5N1禽流感病毒由于其HA蛋白的突变而具有高致病性，并能够跨物种传播到哺乳动物[7]、[8]。

目前的抗病毒策略主要针对病毒表面糖蛋白——神经氨酸酶抑制剂（奥司他韦、扎那米韦）和内切酶抑制剂（巴洛沙韦）或M2离子通道（金刚烷胺）。然而，所有这些类别的药物都迅速出现了耐药性：由于M2突变，金刚烷胺耐药性现已普遍[9]、[10]；奥司他韦耐药性（N1亚型的H275Y）在2008年全球范围内传播[11]；巴洛沙韦耐药性（PA亚型的I38T）在治疗开始后48小时内就被记录到[12]。这些失败案例有一个共同点：它们针对的蛋白质区域可以耐受突变而不导致适应性丧失。

此外，这些药物具有狭窄的抗病毒谱，只能针对特定的病毒酶，无法提供对异源病毒株或新型大流行威胁的交叉保护[13]。从头设计新型化学实体的开发需要漫长的时间（10-15年）和巨额资金投入，且淘汰率很高[14]。因此，根本性的新型抗流感机制的研发进展缓慢，全球大流行准备仍然依赖于具有特定病毒株效力的疫苗和效力逐渐减弱的抗病毒药物[15]、[16]。这些限制突显了迫切需要能够规避流感病毒进化适应性的广谱、耐耐药性的抗病毒策略[17]。

本研究采用了一种针对进化保守的蛋白质结构域的策略，这些结构域的突变受到基本功能的限制。M2跨膜结构域就是一个例子：尽管在多种亚型（H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N9）中经历了80年的进化，但其19个残基的跨膜片段仍保持超过98%的氨基酸同一性[17]。M2跨膜结构域形成一个pH激活的质子通道，其中四聚体的His37残基作为质子门，Trp41残基作为通道出口[18]。His37具有双重功能：在酸性pH下质子化会触发通道开放，而咪唑环有助于质子选择性[19]。突变研究表明，H37A突变会消除质子传导性和对金刚烷胺的敏感性，表明该残基对通道功能和药物结合至关重要[20]。相比之下，Asn31通过螺旋间氢键稳定闭合构象；在金刚烷胺耐药性菌株中常见的N31S突变改变了通道动力学，但不影响其功能，这与它的结构作用一致[21]、[22]。Val27、Ala30和Gly34残基构成了疏水药物结合口袋[23]、[24]。

在这里，我们对临床批准的药物进行了基于结构的虚拟筛选，这些药物针对AlphaFold3预测的M2跨膜结构域，发现了临床使用的Ia类抗心律失常药物Ajmaline作为候选抑制剂。Ajmaline是一种单萜吲哚生物碱（MIA），1931年从Rauvolfia serpentina中分离出来（图1），在欧洲和新西兰作为Gilurytmal?上市，目前主要用于布鲁加达综合征的诊断[25]、[26]。分子动力学模拟预测其在80年的进化过程中在多种IAV亚型中具有稳定的结合能力。实验验证证实了其在体外和体内的强抗H1N1活性，细胞热位移测定显示其与M2的结合，且对突变体仍有效。这些发现为针对保守结构域的策略提供了概念验证，并确定了一种具有成熟人体安全性数据的可再利用药物候选物。

抗体和试剂

使用的抗体包括：甲型流感病毒核蛋白/NP抗体（Sino Biological 11675-T62）、单克隆抗Flag M2过氧化物酶抗体（Servicebio GB11938）、山羊抗兔IgG-HRP抗体（Servicebio GB23303）、山羊抗鼠IgG-HRP抗体（Servicebio GB23301）。化学试剂：Ajmaline（Aladdin A303721）、全氟癸烷（Aladdin P169442）、异维斯坦醇（Aladdin I138604）、赤霉素（Aladdin G105690）、维格列汀（Aladdin V125454）、沙格列汀（Aladdin S126752）、美西林（Aladdin

虚拟筛选工作流程和结果

对不同H1N1突变株和流感病毒亚型的蛋白质序列进行比较分析，强调了Matrix 2（M2）蛋白的进化保守性。尽管亚型之间存在轻微的序列差异，但这种内在的保守性使M2成为开发广谱抗病毒药物的战略目标。序列比对显示，M2跨膜结构域（TMD）在近八十年的多种H1N1菌株中保持高度保守

讨论

本研究为针对进化保守的蛋白质结构域以克服病毒耐药性提供了强有力的概念验证。通过关注在多个亚型中保持超过86%氨基酸同一性的M2-TMD，我们确定了Ajmaline作为一种能够规避现有突变逃逸的强效候选药物。我们的发现支持了一种协同作用机制：对没有M2的病毒（VSV、EMCV）没有活性，以及Ajmaline无法诱导干扰素产生的现象

CRediT作者贡献声明

陈敏：撰写——原始草案、方法学、研究、数据分析。罗素兰：验证、监督、概念构思。陈文焕：撰写——原始草案、方法学、研究、数据分析。蒋欣怡：软件支持、研究。梁少梅：软件支持、研究。吴启帆：软件支持、数据分析。梁雪：研究、资金获取。魏鹏程：验证、监督、概念构思。刘坤鹏：撰写——审稿

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明

支持本研究结果的数据可应要求向相应作者索取。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（82371774、82500745）、广西研究生教育创新项目（YCSW2025059）、广西百桂青年人才培训计划（GXR-2BGQ2525065）、广西绿色苗才计划（ZX02080033724004）、广西大学培养青年骨干创新人才科技倍增计划（2024BZRC012）以及广州市科技计划（2023A04J1082）的支持。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。

缩写

Ajm

Ajmaline

CETSA

细胞热位移测定

CCK-8

细胞计数试剂盒-8

DMSO

二甲基亚砜

EMCV

脑心肌炎病毒HSV-1 单纯疱疹病毒1型

H1N1

甲型流感病毒H1N1亚型

H9N2

甲型流感病毒H9N2亚型

IFN-β

干扰素-β

ISG56

干扰素刺激基因56

M2

基质蛋白2

MD

分子动力学

PBS

磷酸盐缓冲液

RT-qPCR

逆转录-定量PCR

RMSD

均方根偏差

SeV

仙台病毒

THP-1

人急性单核细胞