《Biomaterials》：Reassembly nanomaterials-mediated engineered bacteria lysis for reshaping immunosuppressive microenvironment
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本研究构建了细菌-纳米材料混合系统（IE-PPCs），通过基因工程改造的大肠杆菌Nissle 1917携带IFN-γ基因，并共价结合MMP响应性PPCs纳米颗粒。在肿瘤微环境中，PPCs受MMPs激活转化为纤维状结构，暴露抗菌肽引发细菌裂解，持续释放IFN-γ和裂解产物。联合PD-L1抗体在4T1小鼠模型中实现89.7%的抑癌率，显著降低肿瘤内细菌负载（98.9%），有效逆转“冷”肿瘤免疫抑制状态，为癌症治疗提供新策略。
张婷杰|杨建科|程国锋|孟凡虎|李玉鹏|王静桥|李龙飞|毕双宇|陈希光|刘雅
中国海洋大学海洋生命科学学院，青岛，266003，中国
摘要
细菌疗法是一种有前景的策略，可以通过细菌固有的肿瘤定向能力和免疫调节能力来重塑“冷”肿瘤的免疫抑制微环境。可以通过同步裂解电路或外部物理触发器（例如光热和磁热方法）对细菌进行基因改造，使其在肿瘤部位精确且持续地释放免疫激活剂。然而，肿瘤微环境（缺氧和酸性）会干扰基因表达效率，而且细菌代谢物（丁酸和乳酸）具有潜在的促肿瘤风险。在这项研究中，我们开发了细菌-纳米材料混合系统（IE-PPCs），以实现免疫因子的稳定可控递送，同时提高治疗安全性。将IFN-γ基因转入E. coli Nissle 1917（EcN）菌株，并将其锚定在由抗菌肽、MMP可切割肽和亲水性PEG组成的PPCs上。在给药前，通过IPTG诱导精确调控IE-PPCs中的IFN-γ表达。静脉注射后，IE-PPCs选择性地在肿瘤微环境中定植，然后MMP响应的PPCs自发地转化为纤维状纳米结构，暴露出抗菌肽残基，从而裂解细菌并释放IFN-γ和细菌裂解物。IFN-γ直接抑制肿瘤增殖，而与细菌裂解物结合使用则可诱导树突状细胞成熟并促进M1型巨噬细胞的极化。在4T1小鼠乳腺癌模型中，IE-PPCs与抗PD-L1疗法联合使用，实现了89.7%的抗肿瘤率，肿瘤内的细菌负荷减少了98.9%。IE-PPCs系统为重塑免疫抑制微环境提供了一种突破性策略，为癌症患者提供了可靠且具有吸引力的治疗选择。
引言
肿瘤免疫疗法是一种革命性的方法，利用免疫系统对抗癌症，相比传统疗法取得了显著进展[1]。尽管肿瘤免疫疗法具有巨大潜力，但免疫抑制的肿瘤微环境（TME）被认为是其广泛有效性的主要障碍[2]。TME中的免疫抑制因子，如Treg细胞和髓系来源的抑制细胞的广泛活跃，导致了“冷”免疫微环境的形成[3],[4]。这种“冷”环境的特征是缺乏免疫细胞浸润和炎症信号不足，限制了免疫疗法的效果[5],[6]。将TME从“冷”状态转变为更具免疫活性的“热”状态，有望大幅改善治疗效果。目前的策略主要集中在增强免疫识别[7],[8],[9]（STING激动剂、mRNA疫苗、免疫检查点阻断剂和IFN-γ）、缓解免疫抑制（抑制Tregs、MDSCs及其信号通路）以及利用肿瘤细胞损伤释放抗原[11],[12],[13]（放疗、化疗、溶瘤病毒等）。然而，实体瘤中异常的血管增生、不受控制的细胞增殖和升高的间质液压力（IFP）使得传统药物递送系统难以以足够的浓度到达目标细胞[14],[15]。高效的肿瘤内递送策略对于重塑“冷”肿瘤的免疫抑制状态和改善肿瘤免疫疗法的效果具有重大价值。
某些类型的细菌，如大肠杆菌（Colibacillus）、沙门氏菌（Salmonella）或梭菌（Clostridium），能够突破血肿瘤屏障并在TME中存活，已被研究作为将药物、基因或治疗剂直接递送到肿瘤部位的载体[16]。此外，细菌具有丰富的病原体相关分子模式（PAMPs），如脂多糖（LPS）、肽聚糖（PGN）和鞭毛，这些可以被树突状细胞（DCs）、巨噬细胞和中性粒细胞上的模式识别受体（PRRs）识别，从而触发相应的免疫反应[17],[18]。然而，这些细菌载体单独使用的免疫刺激潜力仍然不足以引发强烈的抗肿瘤免疫反应。通过基因工程改造细菌以携带免疫激活剂或抗肿瘤因子可以增强免疫激活，通常是通过构建同步裂解电路（SLC）在达到阈值种群密度时同步裂解[19],[20]，或者通过光热[22]、磁热[23]等方法实现细菌的时空控制裂解和药物释放。此外，细菌裂解物和DNA通过Toll样受体（TLRs）和cGAS-STING信号通路在刺激先天性和适应性免疫方面起着关键作用[24]。然而，复杂的免疫抑制TME可能会干扰细菌基因表达的效率和稳定性，导致治疗相关基因表达的波动[25]。此外，工程改造的细菌在肿瘤部位表达治疗基因需要时间，它们的代谢活动可能产生副产物（如丁酸、乳酸），这些副产物可能促进肿瘤生长、血管生成和转移，最终削弱治疗效果[26]。因此，需要开发创新的方法来克服这些缺陷。
本文构建了一种细菌-纳米材料混合系统，以重塑“冷”肿瘤的免疫抑制状态并增强抗肿瘤免疫疗法（图1）。将IFN-γ表达质粒转入E. coli Nissle 1917（EcN）菌株，并在给药前用IPTG（异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷）处理，以精确控制基因表达。设计了在基质金属蛋白酶（MMPs）存在下形态发生变化的聚合物-肽结合物（PPCs），包含三个部分：抗菌肽、酶可切割肽和亲水性PEG。PPCs自组装成纳米颗粒，然后通过酰胺键共价连接到EcN的表面（IE-PPCs）。在主动靶向TME后，PPCs纳米颗粒在MMPs高表达的情况下发生结构转变，形成纳米纤维。这种转变暴露了内部的抗菌肽片段，这些片段包裹在细菌表面并触发细菌裂解和IFN-γ释放。细菌裂解物和释放的IFN-γ协同作用，极化了M1型TAM细胞，诱导树突状细胞成熟并重新编程免疫抑制的TME。通过检测肿瘤凋亡、T淋巴细胞群体分析和细胞因子分泌，评估了IE-PPCs与PD-L1抗体Atezolizumab联合使用的抗肿瘤治疗效果。我们假设IE-PPCs代表了一种重塑“冷肿瘤”免疫抑制状态的有前景的方法，并开辟了前所未有的治疗可能性。
材料
N-二甲基甲酰胺（DMF）、三氟乙酸（TFA）和 ninhydrin 从上海华药化学试剂有限公司购买。二氯甲烷（DCM）从北京现代东方科技有限公司购买。氨基酸从上海吉尔生化有限公司购买。双羧基聚乙二醇（HOOC-PEG-COOH）从西安瑞禧生物科技有限公司购买。IFN-γ基因和质粒由北京提供
PPC1和PPC2的制备与表征
PPC1和PPC2通过标准固相合成法制备，并通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化（图S1）。这两种结合物都含有抗菌肽结构域、自组装基序（LVFF）和末端PEG-COOH部分，以调节亲水性/疏水性平衡。PPC2的序列为PLGVRG，可以通过酶处理成PLG和VRG片段[39]，从而去除亲水性PEG末端。
结论
总结来说，我们开发了一种工程化的细菌-纳米材料混合系统（IE-PPCs），实现了靶向肿瘤内的递送，同时重塑了免疫抑制微环境，从而增强了抗肿瘤效果。IE-PPCs具有对肿瘤微环境（TME）的响应性。IE-PPCs使用益生菌E. coli Nissle 1917（EcN）表达IFN-γ，并通过酰胺键与MMP响应的PPC纳米颗粒共价结合。在MMP过度表达的TME中，PPC
CRediT作者贡献声明
陈希光：写作 – 审稿与编辑，方法学。毕双宇：写作 – 审稿与编辑，形式分析。李龙飞：写作 – 审稿与编辑，数据管理。王静桥：写作 – 审稿与编辑，数据管理。李玉鹏：写作 – 审稿与编辑，形式分析。孟凡虎：写作 – 审稿与编辑，实验研究。程国锋：写作 – 审稿与编辑，数据管理。杨建科：写作 – 原稿撰写，方法学，形式分析，数据管理。张婷杰：
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（32471453）、中国国家重点研发计划（2024YFD2402105）、山东省青岛市海洋科学技术中心“前沿技术自由探索”专项基金（编号12-04）以及中国海洋大学海洋生命科学学院大型仪器共享平台的支持。
