经口服给药、具有pH抗性的双涂层细胞外囊泡能够恢复肠道屏障功能并抑制结肠炎

《Biomaterials》：Orally Delivered, pH-Resistant Dual Coated Extracellular Vesicles Restore Intestinal Barrier Function and Suppress Colitis

本研究开发了一种双重涂层外泌体递送系统（DCEVs），通过阳离子脂质DOTAP和硫酸铝实现pH响应性稳定及靶向释放。实验证明DCEVs在Caco-2/THP-1共培养模型中显著提升跨上皮转运效率，并在DSS诱导结肠炎模型中有效恢复结肠长度、紧密连接蛋白表达及IL-10水平，优于传统5-ASA制剂和外泌体单独应用。

　　

蔡元喆 | 罗在元 | 李秀贞 | 朴惠邦 | 李俊勋 | 索圭元 | 南坤 | 金惠珍 | 朴根弘

韩国成均馆大学生命科学学院纳米再生医学工程系，CHA生物综合体6楼，尚南区三坪洞，13488

摘要

炎症性肠病（IBD）的口服治疗需要能够承受胃肠道压力并在发炎黏膜处实现局部作用的药物制剂。然而，现有的基于细胞外囊泡（EVs）或小分子的方法常常因稳定性差和结肠递送能力有限而失败。本研究旨在开发一种双涂层口服递送平台，以增强胃肠道稳定性并实现药物靶向释放。我们改造了巨噬细胞衍生的EVs，依次涂覆阳离子脂质和海藻酸钠（SA），用于包裹5-氨基水杨酸（5-ASA）。这种逐步改变表面电荷的策略保持了EVs的完整性，使其具有抗酸性和抗酶性，并能够在结肠pH值下延迟脱壳。在模拟胃肠道环境的Caco-2–THP-1共培养模型中，双涂层EVs（DCEVs）表现出比未经修饰的EVs更强的上皮摄取能力、跨上皮转运能力和巨噬细胞递送能力。在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎模型中，1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷（DOTAP）促进了内体逃逸，而SA实现了定时释放，从而增加了结肠中的药物浓度，显著恢复了结肠长度，修复了肠道紧密连接，并抑制了促炎细胞因子的表达，同时提高了IL-10的表达水平。这些结果表明，逐步涂层策略可以有效结合EV介导的免疫调节作用与药物治疗，为IBD的局部治疗提供了pH稳定的口服EV平台。

引言

炎症性肠病（IBD）包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD），其特征是胃肠道（GI）持续发炎，导致多种消化系统紊乱。尽管其确切病因尚不清楚，但IBD被认为是由遗传易感性、肠道微生物群失调以及饮食、吸烟和某些药物等环境因素的复杂相互作用引起的[1]。根据全球统计数据，IBD的患病率在早期工业化地区（如美国、欧洲和大洋洲）稳步上升，目前影响了超过1%的人口。预计在未来几十年内这一比例将进一步上升，可能达到1.5%。此外，包括中国、韩国、日本和巴西在内的新兴工业化国家也预计将在2030年代经历类似的快速增长[2],[3]。基于5-氨基水杨酸（5-ASA）的制剂仍然是UC的一线治疗方法，因为它们能够对肠道黏膜发挥局部抗炎作用[4],[5],[6],[7],[8],[9]。然而，这些药物在中度至重度CD中的治疗效果不足，通常需要联合使用免疫调节药物（如硫嘌呤）或针对肿瘤坏死因子（TNF）的生物疗法[11],[12],[13],[14]。此外，传统的5-ASA片剂和肠溶涂层制剂往往过早地从肠道腔内被冲走，黏膜停留时间短，无法在上皮界面达到治疗所需的浓度[15],[16],[17]。因此，提高结肠靶向性和持续释放能力的策略对于改善治疗效果至关重要。

肠道上皮由紧密连接（TJs）组成，这些连接调节细胞间运输并维持组织稳态[18],[19],[20]。TJ完整性的破坏会导致肠道通透性增加，促进腔内抗原的转运，从而引发免疫激活并加剧炎症[21],[22]。因此，同时恢复上皮屏障功能和调节免疫反应的治疗方法在IBD管理中具有重要意义。

细胞外囊泡（EVs）是来自多种细胞类型的纳米级脂质双层囊泡，由于其天然与生物组织的相容性、最小的免疫激活作用以及能够运输来自母细胞的生物活性分子（如蛋白质、脂质和RNA）的能力，已成为有前景的治疗载体[23],[24]。特别是来自M2巨噬细胞的EVs已被报道可以在炎症环境中抑制促炎信号并促进TJ的修复[25],[26],[27],[28],[29]。然而，EVs的口服递送面临诸多挑战。除了牛奶或植物来源的EVs外，大多数EVs在胃等酸性环境和酶的作用下容易降解，容易被黏液层捕获，且上皮转运效率低下[30],[31],[32],[33],[34],[35]。相反，静脉注射会导致EVs被单核吞噬细胞系统（MPS）迅速清除，并在非目标组织中积累[36],[37]。尽管在5-ASA涂层和EV疗法方面取得了进展，但目前还没有一种口服递送平台能够在确保EVs通过胃肠道的同时实现其在发炎结肠处的局部释放。

在这项研究中，我们开发了一种pH响应性的双涂层EV（DCEV）递送系统，以实现5-ASA和M2来源EVs的持续、结肠靶向的口服给药（图1）。DCEVs由通过静电相互作用形成的两层组成。首先，在带负电的EV表面涂覆1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷（DOTAP）脂质，以促进电荷反转，从而便于后续的海藻酸钠涂层和增强内体逃逸，提高上皮跨细胞转运[38],[39]。第二层由5-ASA和海藻酸钠（SA）组成，形成含有大量羧基的阴离子凝胶。SA因其pH响应特性和黏附行为而常用于口服药物制剂中[40],[41],[42]。通过系统地分析SA浓度与外层暴露的Zeta电位和半衰期的关系，我们确定了一个操作窗口，以确保其在胃肠道近端部分的保护作用，并在结肠pH值下控制脱壳过程。这种双涂层策略旨在通过同时促进上皮屏障修复和抑制肠道炎症来最大化治疗效果。

双涂层保留了M2来源EVs的特性并实现了药物装载

为了IBD治疗，我们从THP-1细胞中分离出M2巨噬细胞衍生的EVs。THP-1细胞在IL-4刺激下分化为巨噬细胞，这通过CD68、CD80、iNOS和CD206的表达得到证实（图S1）。通过多步骤纯化过程获得了高纯度的M2来源EVs。通过切向流过滤（TFF）和尺寸排阻色谱（SEC）纯化的EVs进行SDS-PAGE比较，结果显示SEC纯化的EVs...

讨论

在DSS结肠炎模型中，DCEVs在结肠长度、组织学恢复、TJ蛋白表达和IL-10诱导方面的改善程度超过了单独使用口服5-ASA或EVs的效果。值得注意的是，大多数关于5-ASA的临床前研究采用每日口服给药，而本研究中DCEVs每三天给药一次，但仍产生了持续的治疗效果。这些发现支持了我们的假设，即逐步涂层能够增强...

结论

我们开发了DCEVs，这是一种多层口服递送系统，用于同时递送EVs和小分子药物。该平台具有海藻酸钠外壳，可保证pH稳定性并黏附于黏膜；中间层为阳离子层，有助于促进上皮转运；EV核心具有内在的免疫调节活性。双涂层策略保持了EV的完整性，实现了高效的药物装载，并在不同pH值和胃肠道条件下提高了稳定性。

细胞培养

THP-1细胞系（TIB-202）来自ATCC（美国马里兰州），并在添加了10% FBS和1% 抗生素-抗真菌溶液的RPMI-1640培养基中培养。通过定期添加新鲜培养基，细胞浓度维持在1 × 10⁶ cells/mL^?1以下。为了诱导巨噬细胞分化，THP-1单核细胞用50 ng/mL^?1 PMA处理24小时，然后洗涤并休息24小时。对于M1极化，巨噬细胞用20 ng/mL^?1 LPS处理24小时；对于M2...

CRediT作者贡献声明

李俊勋：可视化、资源准备。 索圭元：可视化、资源准备。 南坤：验证、监督。 金惠珍：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、方法学研究、资金获取、数据管理。 朴根弘：撰写 – 初稿撰写、监督、项目管理、资金获取、数据管理、概念构思。 蔡元喆：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、项目管理。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。

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利益冲突声明

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致谢

本工作得到了韩国政府（NRF）的资助（资助编号RS-2019-N840073和NRF-2022R 1C1C2005248）。在准备这项工作时，作者使用了ChatGPT（OpenAI，美国加州旧金山）辅助语言编辑。使用该工具后，作者根据需要审查和修改了内容，并对发表文章的内容负全责。