《Biomaterials Advances》：Hierarchical scaffolds amalgamating bFGF-immobilized fibrous yarn bundles with cryogel tube for tendon tissue engineering
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修复受损肌腱的纤维支架与生长因子复合系统研究，通过静电纺丝制备含肝素的明胶/聚己内酯微纤维纱线（GpH），利用肝素结合bFGF实现可控释放，结合明胶/透明质酸冷冻凝胶管（GHCT）构建仿生分层支架，兔实验证实其可显著促进十细胞增殖、胶原I型沉积及机械性能恢复，组织学特征接近天然肌腱。
Darshan Tagadur Govindaraju|Chih-Hao Chen|K.T. Shalumon|Hao-Hsi Kao|Jyh-Ping Chen
台湾桃园市魁山长庚大学化学与材料工程系，邮编33302
摘要
组织工程是修复受损肌腱的一种有前景的策略。肌腱组织工程支架应具有与肌腱相似的层次结构，并提供足够的机械刚度和强度。为满足这一需求，我们将对齐的明胶/聚己内酯/肝素微纤维扭曲成纤维纱线（GPHY）。基本成纤维细胞生长因子（bFGF）通过肝素结合到纱线上，肝素作为种子化肌腱细胞的生化信号。然后将FGF-GPHY束与多孔明胶/透明质酸冷冻凝胶管（GHCT）结合，以防止术后粘连。这种管状bFGF-GPHY@GHCT复合支架可以提供来自释放的bFGF的生化信号，以及来自其各向异性纤维结构或在生物反应器中动态细胞培养中的单轴循环拉伸载荷的生物物理信号。我们对支架的性能及其与兔肌腱细胞的相互作用进行了全面表征，证明了其有效性和潜在应用。机械刺激可以显著提高肌腱细胞的增殖率，并有助于维持其肌腱生成表型。细胞/支架结构还表现出改善的机械性能。在兔跟腱缺损模型中，动态培养的细胞/支架结构显示出出色的肌腱组织再生能力，其组织学特性与天然肌腱相当。创建一种模仿肌腱结构并有效结合生化和生物物理信号的层次化bFGF-GPHY@GHCT支架可能是修复肌腱缺损的成功策略。
引言
肌腱是负责肌肉与骨骼物理连接的结缔组织，通过传递肌肉力量来实现关节运动。它们由对齐的胶原纤维组成为核心，结合了细胞外基质（ECM）和一些细胞成分[1]。肌腱的层次结构是通过胶原分子形成原纤维，这些原纤维依次聚集成纤维和束状结构[2]。肌腱的管状结构由外膜（epitenon）提供，这是一种松散的血管化结缔组织鞘，包裹所有束状亚单位。外膜外是内膜（paratenon），可以减少与相邻组织的摩擦[3]。束状结构的直径范围为150至500微米，由紧密排列的卷曲胶原纤维组成[4]。束状结构为肌腱的整体组织和机械强度提供了基本单元。每个束状结构周围是一层称为内膜（endotenon）的薄膜，它包裹着胶原纤维束并将这些纤维束分成束状亚单位[5]。这种内部结构代表了肌腱的整体组织和机械强度的基本单元，并允许力的传递和运动。内膜通过包裹这些纤维束，有助于肌腱的层次化组织以承受各种力量[6]。内膜和束状结构中的肌腱细胞可以分泌生长因子和ECM，以维持肌腱的稳态。
由于天然肌腱的再生能力有限和愈合后功能受损，修复受伤的肌腱具有挑战性[7]。肌腱缺损可以通过同种异体移植或自体移植来修复。同种异体移植受到多种因素的限制，如供应不足和感染疾病传播的风险。自体移植通常移植效率低且生物力学强度不足，使得重建的肌腱容易再次受伤[8]。相比之下，组织工程方法结合了细胞、生长因子和支架这三个重要组成部分，对于肌腱修复具有前景[9]。支架可以与细胞相互作用，为细胞生长提供有利的环境[10]。除了具有生物相容性和可降解性外，支架最好具有与再生组织相似的形态结构[11]。可以使用天然和合成可降解聚合物来制造支架，尽管两者都有其局限性。天然聚合物可以模仿天然ECM成分，但与合成聚合物相比机械强度较低，且降解速度较快。在支架制备中结合天然和合成聚合物可以调整支架的所有理想特性并克服这些缺点。
作为合成聚合物，聚己内酯（PCL）是疏水性的，细胞附着和增殖能力较差[12]。明胶是一种源自胶原蛋白的蛋白质，具有较低的免疫原性。作为ECM成分的衍生物，明胶由于其可降解性和生物相容性，是一种优秀的天然聚合物材料[13]。通过将其与PCL混合，可以克服明胶较差的机械性能。作为支架材料，明胶由于其重复的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列，支持细胞附着、迁移和增殖。这种独特的氨基酸序列可以被细胞表面的整合素受体识别，在细胞迁移和组织发育等生物过程中起关键作用[14]。肝素是一种糖胺聚糖（GAG），是主要的ECM成分。它因其抗凝血和抗血管生成特性而广受认可[15]。由于其高负电荷，肝素作为支架材料可以与带正电的生长因子发生强烈的静电相互作用，防止生长因子的突然释放并维持持续的治疗效果[16]。生长因子与肝素的特异性结合可以保护它们免受蛋白水解，保留其长期活性，包括基本成纤维细胞生长因子（bFGF）[17]。
能够持续释放bFGF的支架可以在组织修复中实现精确的时空干预[18]。在肌腱修复过程中，释放的bFGF可以通过促进肌腱来源的成纤维细胞（肌腱细胞）的增殖和迁移以及增强ECM成分的合成来同步加速肌腱再生。释放的bFGF可以通过刺激肌腱细胞分泌I型胶原（collagen I）来促进早期肌腱修复，并在重建后期促进III型胶原（collagen III）向I型胶原的转化，从而恢复肌腱的强度和功能[19]。在肌腱修复的早期阶段，bFGF可以促进血管生成并引发炎症反应，产生促炎因子，加速肌腱修复[20]。我们制备了一种含有对齐的明胶/肝素/PCL纳米纤维的螺旋伤口支架，并将bFGF固定在支架上，用于修复兔跟腱缺损[21]。对齐的纳米纤维结构提供了支持种子化肌腱细胞的生物物理信号，而bFGF提供了有助于维持肌腱生成表型的生化信号。在另一项研究中，bFGF被固定在编织的、用缝线加固的PCL纤维纱线束表面的肝素上。通过对PCL进行氧等离子体表面处理后，可以将肝素结合到纱线上，用于修复兔手指伸肌腱缺损[22]。
电纺是一种多功能的技术，可用于组织工程中的支架制备，可生产纳米到微米级的纤维。此外，通过控制工艺参数，电纺可以从天然和/或合成聚合物生成随机或对齐的纤维[23]。由电纺纤维制成的支架的一个关键优势是它们可以复制天然ECM中发现的3D复杂基质纤维结构[24]。由电纺纳米纤维组成的支架可能具有较小的孔径，但仍保持足够的孔隙率。这种设计有利于细胞附着在纤维表面，并允许某些细胞渗透，确保适当的营养扩散以促进细胞生长[25]。对于肌腱组织工程，人们关注于通过电纺生产各向异性对齐的纤维支架。它们可以提供对肌腱再生如何受到地形信号影响的更深入理解。最近，通过编织、编织或扭曲等方法制备的纤维支架已经开发出来，这些支架具有适合肌腱组织工程的适当机械性能[26]。然而，确保电纺纳米纤维中的地形正确对齐对于防止附着在其表面的肌腱细胞表型漂移至关重要。此外，对齐的纤维结构可以模仿ECM的组织结构，可能鼓励干细胞分化为肌腱细胞。这种分化对于形成与天然肌腱组织密切相似的细胞组织和基质沉积至关重要[27]。研究表明，细胞/支架结构的生物特性，特别是使用肌腱细胞时，受到基底长度尺度的显著影响。支架特征的大小和排列可能影响肌腱细胞的行为，包括蛋白质表达和基质沉积，从而影响肌腱相关的组织再生[28]。为了有效开发，肌腱组织工程支架必须满足机械要求，并解决肌腱组织的独特非线性生物力学行为。此外，建立适当的结构和地形信号对于维持肌腱细胞的表型和保持肌腱组织工程中的关键特性至关重要[29]。最终，制造用于肌腱细胞工程的支架的目标是在功能性支架中结合所有必要的特性，包括模仿束状结构和肌腱ECM的层次化及各向异性对齐结构的能力。
术后粘连是肌腱修复后常见的并发症[30]。这些粘连是周围组织与修复后的肌腱之间形成的疤痕组织，可能会限制肌腱的平滑滑动。这种限制可能导致僵硬和活动范围减少。虽然粘连的形成是愈合过程的自然部分，但当它限制肌腱运动时可能会成为问题。由可降解和生物相容性材料制成的冷冻凝胶可以有效防止术后粘连[31]。由明胶和透明质酸（HA）交联形成的冷冻凝胶可以用作屏障，将组织分开并防止粘连，同时容纳纱线束。冷冻凝胶作为物理屏障，分离组织并防止愈合过程中的直接相互作用，从而降低粘连形成的可能性[32]。因此，我们打算制备一种明胶/HA多孔冷冻凝胶管作为屏障，以防止肌腱周围粘连，并将其与纱线束结合，构建一种坚固的层次化支架用于肌腱修复。为此，我们首先通过混合电纺明胶、PCL和肝素制备了对齐的电纺纤维。通过对齐的微纤维进行收集，并通过金属棒固定，然后通过旋转纱线收集器将其制成纱线。我们将bFGF固定在明胶/PCL/肝素纱线（GPHY）的表面，以实现其从纱线中的可控释放。然后将bFGF-GPHY束与明胶/HA冷冻凝胶管（GHCT）结合，组装成层次化的bFGF-GPHY@GHCT支架。扭曲的各向异性结构微纤维形成类似束状结构的纱线，管状结构的纱线束提供了类似肌腱层次结构的高强度复合支架。它已成功用于修复兔跟腱缺损。
材料
本研究中使用了明胶（A型，来自猪皮）、聚己内酯（PCL）（平均分子量=80,000 Da）、透明质酸（HA）（平均分子量=13,000,000）、肝素钠盐、Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）（来自Sigma-Aldrich）。Phalloidin-tetramethylrhodamine B异硫氰酸盐（Phalloidin-TRITC）和Hoechst 33258用于F-actin和细胞核染色，Live/Dead活力/细胞毒性试剂盒。
扫描电子显微镜/能量分散X射线光谱（SEM/EDS）
SEM下观察到的bFGF-GPHY的形态显示，纱线直径约为0.28毫米，含有直径为1.28±0.41微米的纤维（图2A）。纱线中的对齐纤维具有光滑的形态，没有珠状形成（图2B）。GHCT的SEM图像显示了具有相互连接孔隙的多孔结构（图2C）。从SEM图像估计的平均孔径为13.5±1.8微米（图2D）。GHCT的外径和内径分别为3毫米和2毫米（图2E）。
结论
本研究通过收集和扭曲电纺明胶/PCL/肝素纤维，制备了一种纤维GPH纱线。通过将纱线的两端系紧并将七根单根纱线插入明胶/透明质酸冷冻凝胶管的管腔中，我们开发了一种用于肌腱组织工程的高强度支架。该支架通过生物亲和相互作用实现了bFGF的固定和稳定，使得能够结合来自bFGF的生化信号和生物物理信号。
CRediT作者贡献声明
Darshan Tagadur Govindaraju：撰写——原始草稿、方法学、研究、数据分析、概念化。Chih-Hao Chen：监督、项目管理、方法学、数据分析、概念化。K.T. Shalumon：验证、方法学、数据分析、概念化。Hao-Hsi Kao：监督、项目管理、资金获取。Jyh-Ping Chen：撰写——审阅与编辑、验证、监督、资源管理、项目管理、方法学。
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：
Jyh-Ping Chen报告称获得了科技部的财政支持。如果有其他作者，他们声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
我们感谢台湾科技部（MOST109-2314-B-182-013-MY3）的财政支持。同时感谢长庚大学显微镜中心和长庚纪念医院显微镜核心实验室的技术支持。
