《Microbiology Research》：Characterization, Virulent-Determinants, Antimicrobial Resistance, and MALDI-TOF MS Proteomic Profile of Nontyphoidal Salmonella Isolated from Chicken Meat in Fukuoka, Japan
Khin Zar Linn,
Su Zar Chi Lwin,
Aye Thida Maung,
Marwa Nabil Sayed Abdelaziz,
Catherine Damaso Hofilena,
Yuzhi Lin,
Haomin Ye,
Yoshimitsu Masuda,
Takahisa Miyamoto and
Ken-ichi Honjoh
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为评估鸡肉来源非伤寒沙门菌(NTS)的潜在公共卫生风险，本研究对日本福冈的零售鸡肉样本进行了系统调查。研究人员通过分离鉴定、血清分型、多位点序列分型(MLST)、MALDI-TOF MS蛋白谱分析、毒力基因检测、生物膜形成能力及抗菌药物敏感性(AMR)测试，揭示了S. enterica ser. Schwarzengrund为优势菌株(78.1%)，其具有强生物膜形成能力及多重耐药性(MDR)，并首次在日本分离株中检出qnrA基因，强调了整合基因型与表型方法进行持续监测的重要性。
想象一下，您在日本福冈的一家餐厅，正准备享用一份当地特色的“鸟刺身”（生鸡肉料理）。然而，这道美食背后可能潜藏着一个看不见的威胁——非伤寒沙门菌（Nontyphoidal Salmonella, NTS）。这是一种全球性的食源性人畜共患病原体，是导致人类急性胃肠炎的主要原因之一。鸡肉及其制品被认为是NTS感染的主要来源。在日本，特别是九州地区（包括福冈），食用生鸡肉的文化可能增加了人畜共患的风险。尽管日本自2011年以来，食源性沙门菌病的年报告病例数已降至50例以下，但每次沙门菌疫情的平均患病人数（38人）仍远高于弯曲菌疫情。更令人担忧的是，抗菌素耐药性（Antimicrobial Resistance, AMR）的日益严重，包括多重耐药（Multidrug-Resistant, MDR）沙门菌的出现以及对关键抗菌药物（如第三代头孢菌素和氟喹诺酮类）的耐药性，正在全球范围内蔓延，这严重影响了人类沙门菌病的治疗选择。世界卫生组织已将沙门菌列为急需新抗菌药物的高优先级耐药细菌。然而，关于日本福冈地区鸡肉中沙门菌，特别是其耐药性、毒力及分子特征的最新数据仍然有限。在此背景下，一项发表于《Microbiology Research》的研究应运而生，旨在系统揭示福冈零售鸡肉中NTS的流行状况、血清型分布、毒力潜力、生物膜形成能力及其抗菌药物耐药性，为公共卫生风险评估和持续监测提供关键数据。
为开展此项研究，研究人员在2023年12月至2024年8月期间，从日本福冈的十家零售店随机购买了50份不同品牌和部位的新鲜（冷藏）鸡肉样本。研究采用了一系列关键技术方法：首先，依据ISO 6579:2002标准进行沙门菌的分离与分子确认（靶向invA基因）。其次，结合传统血清凝集和多重PCR方法对分离株进行血清分型。运用多位点序列分型（Multilocus Sequence Typing, MLST）对七个看家基因进行测序以确定序列型（Sequence Type, ST）。利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS）进行蛋白指纹图谱分析和聚类。通过PCR检测关键毒力基因（hilA, spiC, ssrB, spvC）。采用微孔板结晶紫染色法定量评估生物膜形成能力。最后，通过肉汤微量稀释法和纸片扩散法进行抗菌药物敏感性试验，并对相关耐药基因（如tetA, sul1, aphA1, aadA1, qnrA等）及gyrA基因的喹诺酮耐药决定区（Quinolone Resistance-Determining Region, QRDR）突变进行PCR检测与测序分析。
3.1. 鸡肉中沙门菌的流行率与血清型分布
在50份鸡肉样本中，有32份（64%）沙门菌检测呈阳性，共分离出32株NTS。所有十家零售店都至少有一份阳性样本。通过血清分型鉴定出三种血清型：肠炎沙门菌施瓦岑格隆变种（S. entericaser. Schwarzengrund）（占78.1%）、肠炎沙门菌汤普森变种（S. entericaser. Thompson）（占15.6%）和肠炎沙门菌奥拉宁堡变种（S. entericaser. Oranienburg）（占6.3%）。施瓦岑格隆是绝对优势血清型。
3.2. 分离株的序列型（ST）
32株分离株被归为三种ST：ST241（78.1%）、ST26（15.6%）和ST23（6.3%）。所有施瓦岑格隆分离株均属于ST241，所有汤普森分离株属于ST26，而两株未明确分型的分离株（后推测为奥拉宁堡）属于ST23，显示出血清型与ST之间存在强关联。
3.3. 分离株的MALDI-TOF MS分析
所有分离株均被准确鉴定到种水平。基于蛋白质谱的主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）树状图显示，32个分离株被分为六个簇（I–VI），表明即使在同一ST内，分离株的蛋白质表达也存在异质性。这种聚类与部分分离株的血清型、ST、耐药表型、毒力基因和生物膜形成能力等特征有一定关联，但也存在差异，提示蛋白质谱分析能提供额外的分型信息。
3.4. 分离株中毒力因子编码基因
所有分离株（除一株施瓦岑格隆缺失spiC外）均携带位于沙门菌致病岛（SalmonellaPathogenicity Island, SPI）上的毒力基因hilA、spiC和ssrB。然而，与系统性感染相关的毒力质粒基因spvC在所有分离株中均未检出。
3.5. 沙门菌分离株的生物膜形成能力
定量评估显示，25株施瓦岑格隆中，22株（88%）能形成强生物膜，3株（12%）形成中等强度生物膜。5株汤普森中，4株（80%）形成弱生物膜，1株形成中等强度生物膜。两株奥拉宁堡未显示生物膜形成能力。这表明优势菌株施瓦岑格隆具有强大的生物膜形成潜力。
3.6. 浮游沙门菌分离株的抗菌药物敏感性
所有汤普森和奥拉宁堡分离株对所测试的所有抗菌药物均敏感（汤普森对米诺环素和环丙沙星存在中介度）。与之形成鲜明对比的是，施瓦岑格隆分离株对多种抗菌药物表现出耐药性：88%耐卡那霉素，80%耐四环素，40%耐复方新诺明（磺胺甲噁唑/甲氧苄啶），28%耐链霉素，20%耐米诺环素，12%耐萘啶酸。此外，64%的施瓦岑格隆分离株对关键治疗药物环丙沙星呈中介度。在25株施瓦岑格隆中，有9株（36%）被确定为MDR（对至少三类抗菌药物耐药），并呈现出六种不同的耐药模式。
3.7. 生物膜沙门菌分离株的抗菌药物敏感性
对生物膜状态下的细菌进行药敏测试发现，与浮游状态相比，生物膜细胞对所有测试抗菌药物的敏感性显著降低。大多数分离株对哌拉西林、头孢噻肟、氨曲南、美罗培南、庆大霉素、磷霉素及复方新诺明表现出极高的最小生物膜抑制浓度（Minimal Biofilm Inhibitory Concentration, MBIC，通常>512 μg/mL）。相比之下，米诺环素（MBIC 16–64 μg/mL）和环丙沙星（MBIC 0.5–2 μg/mL）的MBIC值相对较低，但仍高于其对应的最小抑菌浓度（Minimal Inhibitory Concentration, MIC）。
3.8. 通过PCR检测与抗菌素耐药性相关的基因
基因型检测结果与表型耐药基本吻合。所有对四环素和复方新诺明耐药或中介的施瓦岑格隆分离株均检出tetA和sul1基因（100%）。95.5%的耐卡那霉素分离株携带aphA1基因，95%的对链霉素耐药或中介的分离株携带aadA1基因。在对萘啶酸耐药/对环丙沙星中介的分离株中，发现了gyrA基因QRDR区突变（D87G, S83E, D87A, A67S）。尤为重要的是，在56.3%的对环丙沙星中介但对萘啶酸敏感或中介的分离株中，检出了质粒介导的喹诺酮耐药（Plasmid-Mediated Quinolone Resistance, PMQR）基因qnrA。这是首次在日本沙门菌分离株中报道qnrA基因。
本研究得出结论，日本福冈零售鸡肉中非伤寒沙门菌的污染率较高（64%），优势血清型为肠炎沙门菌施瓦岑格隆变种。该血清型与ST241克隆强相关，并普遍携带SPI-1和SPI-2相关毒力基因，具备强大的生物膜形成能力。最值得关注的是其广泛的抗菌药物耐药性表型，超过三分之一为多重耐药菌株，且首次在日本分离株中检出可转移的qnrA基因，这可能导致氟喹诺酮类药物敏感性进一步降低。尽管与日本早期研究相比，总体耐药率有所下降，可能反映了国家抗生素管理行动的成效，但施瓦岑格隆血清型流行率的持续上升及其携带的新型耐药基因，构成了潜在的食品安全与公共卫生风险。研究强调，沙门菌在生物膜状态下对抗菌药物的耐受性显著增强，这增加了清除难度。MALDI-TOF MS蛋白谱分析揭示了传统分型方法未发现的菌株间异质性，凸显了整合基因型（MLST、耐药基因检测）与表型（血清分型、药敏、蛋白谱）方法进行综合监测的重要性。这项研究为理解福冈地区鸡肉源沙门菌的当前流行特征、耐药趋势及潜在风险提供了关键数据，警示需持续监测家禽养殖链中的沙门菌，特别是关注qnrA等可移动耐药基因的传播，以制定有效的防控策略和医疗干预措施。
