《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Targeted cytosolic delivery of mRNA immunotherapeutics: From vaccine delivery to protein replacement
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这篇综述系统阐述了mRNA免疫疗法的靶向胞浆递送策略，涵盖疫苗、基因编辑和蛋白替代等多领域应用。作者创新性地提出了CIEE（循环-内化-内体逃逸-表达）多步递送概念框架，重点剖析了纳米技术（如LNPs）在克服mRNA递送障碍、实现器官/细胞（特别是抗原呈递细胞APCs）精准靶向及优化内体逃逸与胞浆转染效率方面的前沿进展，为下一代mRNA疗法的理性设计提供了重要参考。
mRNA免疫疗法的崛起与挑战
信使RNA（mRNA）疗法已彻底改变了现代医学的面貌。最初作为疫苗平台开发的mRNA技术，现已迅速扩展到基因编辑和蛋白替代治疗领域。COVID-19大流行期间mRNA疫苗的快速开发和全球部署，突显了该模式的通用性和临床潜力，也推动了其在传染病和遗传性疾病治疗方面的快速进步。mRNA的工作原理是利用宿主细胞系统产生所需的蛋白质，然而，其临床转化仍受到固有稳定性差、细胞摄取有限、内体逃逸效率低以及蛋白表达欠佳等挑战的制约。
mRNA的结构蓝图
功能性的mRNA构建体需要几个必需的结构元件，包括非翻译区（UTRs）、5‘帽结构（如m7G）和3’多聚腺苷酸尾。这些组件共同调节转录本的稳定性、翻译效率和细胞内定位。通过体外转录技术可以规模化生产高质量的mRNA。对mRNA本身的工程化改造，如优化UTR序列、使用修饰核苷（如假尿苷Ψ和1-甲基假尿苷m1ψ）以及优化密码子使用，可以显著增强其稳定性、翻译效率并降低免疫原性。
除了常规mRNA，还出现了增强表达持久性和效力的替代RNA形式。自我扩增RNA（saRNA）编码抗原和病毒非结构蛋白，可在细胞内复制，从而以更低剂量实现更持久的蛋白表达。环状RNA（circRNA）具有共价闭合的环状结构，能抵抗核酸外切酶降解，增强转录本持久性。跨扩增RNA（taRNA）则将抗原和复制酶组件分离到两个不同的RNA片段中，提供了模块化的设计灵活性。
mRNA递送的挑战与CIEE框架
成功的mRNA治疗需要克服一系列生物屏障，包括理化不稳定性、非预期的免疫激活、低效的细胞摄取和脱靶的生物分布。靶向mRNA递送可以概念化为一个多步骤过程，即循环-内化-内体逃逸-表达（CIEE）。
1. 体循环：纳米颗粒的生存考验
给药后，纳米颗粒必须在体循环中保持稳定和生物利用度，抵抗酶降解、机械应激和过早解离，同时避免被单核吞噬细胞系统快速清除。脂质纳米粒（LNPs）是目前应用最广泛、经过临床验证的mRNA递送系统。LNPs由可电离脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇（PEG）-脂质共轭物组成。可电离脂质是mRNA封装和内体逃逸的关键驱动因素；它们在生理pH下呈中性以减少系统毒性，但在酸性内体环境中带正电，促进膜失稳和mRNA的胞浆释放。辅助脂质如DSPC和DOPE分别增强双层完整性和膜融合。胆固醇调节膜流动性，而PEG-脂质则形成亲水外壳，延长循环时间。
然而，纳米颗粒一旦进入生物环境，会迅速吸附蛋白质形成“蛋白质冠”，这改变了其生物特性，深刻影响其细胞摄取、免疫识别和体内命运。蛋白质冠的组成受颗粒大小、形态、表面电荷和化学性质的影响。
2. 靶向抗原呈递细胞（APCs）与内化
将mRNA选择性递送至特定的免疫细胞亚群是下一代疫苗和免疫疗法设计的关键进展。APCs，包括树突状细胞（DCs）、巨噬细胞和B淋巴细胞，是先天免疫和适应性免疫之间的重要桥梁。
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树突状细胞（DCs）：由于其在免疫激活中的核心作用，DCs已成为mRNA疫苗递送的主要靶点。常规DC1（cDC1）擅长交叉呈递，可激活CD8+T细胞，是抗病毒和抗肿瘤免疫的关键。靶向cDC1的策略包括利用其表面标志物XCR1（配体XCL1/2）、CLEC9A和DEC-205。常规DC2（cDC2）则擅长通过MHC II类分子呈递抗原来激活CD4+辅助T细胞。靶向DCIR2和TLR5（配体鞭毛蛋白）可将抗原递送至cDC2。浆细胞样DC（pDC）能产生大量I型干扰素，靶向其表面受体DEC-205、TLR7和BDCA-2可增强抗原交叉呈递。单核细胞来源的DC（moDC）表达Dectin-1和DC-SIGN（CD209），靶向这些受体可增强抗原摄取。朗格汉斯细胞是表皮中的特化DC，靶向其表面标志物朗格汉斯蛋白（CD207）可增强皮肤免疫应答。
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巨噬细胞：巨噬细胞通过吞噬病原体和向T细胞呈递抗原，连接先天和适应性免疫。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是肿瘤微环境的重要组成部分。巨噬细胞可分为促炎的M1型和抗炎/修复的M2型。靶向巨噬细胞甘露糖受体（MR， CD206）是增强疫苗免疫应答的常用策略，甘露糖修饰的纳米颗粒可被巨噬细胞和DC高效内吞。
为了实现细胞特异性靶向，纳米颗粒表面可修饰各种靶向分子，如肽、抗体、碳水化合物或聚合物。例如，唾液酸修饰可靶向DC表面的SIGLEC-1；甘露糖修饰可靶向巨噬细胞/DC的甘露糖受体；使用双特异性抗体作为模块化分子桥，可实现mRNA-LNPs对特定免疫细胞类型的靶向。
3. 靶向递送至免疫器官
将免疫治疗剂高效递送至脾脏和淋巴结等免疫器官至关重要，因为这些部位是免疫激活、协调和调节的主要中心。
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脾脏：作为最大的次级淋巴器官，脾脏含有多种DCs、T细胞、B细胞和巨噬细胞亚群。通过合理设计LNP组分（如可电离脂质的结构、PEG-脂质组成）或利用蛋白质冠效应，可以实现mRNA向脾脏的靶向递送。例如，分支状且可生物降解尾部的可电离脂质可增强向脾脏的靶向递送。
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淋巴结：淋巴结是启动适应性免疫应答的关键部位。某些LNP配方（如113-O12B）显示出对淋巴结的被动趋向性，能在淋巴结DCs和巨噬细胞中实现高效mRNA表达，从而激发强大的抗肿瘤免疫。
4. 内体逃逸：胞浆递送的最后关卡
即使成功被细胞摄取，内体 sequestration 仍是主要瓶颈。胞浆释放而非细胞摄取本身，是产生强大蛋白表达和免疫编程的限速步骤。LNPs中的可电离脂质在酸性内体环境中质子化，引发膜不稳定和融合，促进mRNA释放。其他策略包括“质子海绵”效应、孔形成、膜融合、内体溶解增强剂（如来自病毒的多肽）和光化学破坏等。
5. 表达与免疫激活
一旦mRNA逃逸至胞浆，就会被核糖体翻译成功能蛋白。新合成的抗原进入MHC I类和II类呈递途径。MHC I类处理途径将抗原肽呈递给CD8+T细胞，诱导细胞毒性反应；MHC II类途径则激活CD4+T细胞。CD4+T细胞的帮助进一步支持B细胞激活和抗体产生。这些通路共同作用，协调产生强大的适应性免疫应答，并形成抗原特异性记忆T细胞和B细胞，在再次暴露于相同病原体时提供快速持久的保护。
展望
靶向胞浆递送mRNA免疫疗法是一个快速发展的领域。通过对mRNA分子本身的工程化改造、发展先进的纳米递送系统（如LNPs、聚合物纳米颗粒、杂交颗粒）以及实现细胞和器官水平的精准靶向，研究人员正在不断克服递送屏障。对CIEE通路每个环节的深入理解和优化，将推动下一代mRNA疗法在传染病疫苗、癌症免疫治疗、蛋白替代疗法及其他遗传性疾病治疗中取得更广泛的成功。这需要分子生物学、纳米技术和免疫学知识的深度融合，以实现精细调控的免疫治疗设计。
