由交叉喂养联盟驱动的高效厌氧性二甲双胍生物降解：新途径、酶及毒性动态

《Bioresource Technology》：Efficient anaerobic metformin biodegradation driven by a Cross-Feeding Consortium: Novel Pathways, Enzymes, and toxicity dynamics

本研究利用厌氧膜生物反应器（AnMBR）实现了二甲双胍高达98%的去除率，发现其代谢存在三条新途径，包括首次报道的C-SN键断裂生成二甲胍的途径，并通过分子动力学模拟验证了SpeB酶的催化机制，揭示了毒性在中间产物2,4-AMT达到峰值后衰减的非单调规律，并解析了以Ignavibacterium album和Denitrolinea symbiosum为核心的协同代谢网络。

　　

王欣|梁博军|吴丹妮|张学明|赵和平|赖春宇

浙江大学土壤污染控制与安全国家重点实验室，中国杭州310058

摘要

二甲双胍是全球使用最广泛的抗糖尿病药物之一，目前在水环境中普遍存在，但其厌氧生物降解过程仍很大程度上未被探索，其机制也未得到阐明。本研究采用厌氧膜生物反应器（AnMBR），在进水浓度高达5.3 mg/L的情况下实现了接近完全的二甲双胍去除（约98%），相应的最大降解速率为7.2 mg/L/d，这比之前报道的厌氧系统降解二甲双胍的速率高出约六倍。高分辨率质谱分析确定了三种同时发生的厌氧二甲双胍转化途径。值得注意的是，发现了一种先前未报道的生物C–N键断裂途径，生成二甲基胍，扩展了已知的二甲双胍厌氧代谢途径。计算机模拟毒性预测显示，在二甲双胍转化过程中，毒性呈现非单调变化趋势：中间产物（尤其是2,4-AMT）的毒性短暂升高，最终产物胍的毒性降低。宏基因组学和宏转录组学分析揭示了一个由Ignavibacterium album和Denitrolinea symbiosum主导的协同、互馈微生物网络，并鉴定出HypAB（二甲双胍至胍基脲）、YafV和AmiA/B/C/E（胍基脲至胍）以及关键酶SpeB，后者启动了新的C–N键断裂途径。分子动力学模拟进一步表明二甲双胍与SpeB具有强亲和力，为SpeB介导的新途径提供了机制支持。总体而言，本研究建立了厌氧二甲双胍生物降解的第一个机制框架，揭示了一种前所未有的C–N键断裂途径，并证明通过微生物代谢可以实现高效、低成本的药品去除，为新兴药品污染物的节能处理提供了新的理论和实践基础。

引言

二甲双胍是一种一线抗糖尿病药物，广泛用于治疗2型糖尿病（Wu等人，2017年），过去二十年其全球消费量急剧增加（Yan等人，2019年）。在中国，二甲双胍的年消费量从2014年的990吨增加到2020年的4,562吨（Zheng等人，2023年）；在美国，它成为第四大常用药物，处方数量从2006年的5,450万份增加到2019年的8,570万份（He等人，2022年）。由于二甲双胍具有高水溶性和在常规处理条件下低生物降解性，它已在至少91个国家的水环境中被发现（He等人，2022年），存在于污水处理厂（WWTP）的进水和出水、地表水、沉积物甚至地下水中，浓度范围从ng/L到mg/L不等（Kot-Wasik等人，2016年）。这种广泛存在引发了人们对长期生态和人类健康风险的担忧。

新兴证据表明，环境相关浓度的二甲双胍可能产生显著生物效应。例如，0.39–14 μg/L的二甲双胍会干扰斑马鱼的能量代谢和类固醇激素生物合成（Ambrosio-Albuquerque等人，2021年），突显了其作为代谢和内分泌活性污染物的潜力。因此，开发高效且可持续的二甲双胍去除策略已成为先进废水处理的紧迫任务。

已探索了多种物理化学方法来去除二甲双胍，包括高级氧化（Liao等人，2021年）、自然衰减（He等人，2022年；Tisler和Zwiener，2018年）和氯化（Zhang等人，2021年）。然而，这些方法通常需要化学处理，并可能产生更多有毒副产物。相比之下，微生物生物降解被认为是一种更环保且成本效益更高的方法。在有氧条件下，活性污泥系统已显示出有效的二甲双胍去除效果（Tisler等人，2019年）。后续研究分离出几种能够以二甲双胍为唯一碳源和氮源的厌氧降解菌株（如Aminobacter和Pseudomonas属菌株）（Chaignaud等人，2022年；Li等人，2023年；Martinez-Vaz等人，2022a）。

尽管取得了这些进展，但有氧处理本质上能耗较高，因此人们越来越关注厌氧生物过程，因为它们具有更低的运行能耗、减少的污泥产生和潜在的能量回收（Liu等人，2025年）。初步研究表明厌氧条件下可以实现二甲双胍的降解（Tisler等人，2019年）。Janka等人使用混合垂直厌氧生物膜反应器（HyVAB）实现了接近完全的二甲双胍去除，但只有在添加易于生物降解的共底物（如葡萄糖或丁醇）时才能达到这一效果，这增加了运行复杂性和成本（Janka等人，2019年）。

尽管这些早期研究证明了二甲双胍在厌氧条件下的转化可能性，但我们对厌氧二甲双胍生物降解的理解仍然有限，目前还存在三个关键知识空白，阻碍了实际应用。首先，厌氧二甲双胍去除的固有效率较低，降解时间较长，且无需添加外部共底物即可实现快速稳定去除的策略尚不明确。其次，二甲双胍的厌氧转化途径及其相关毒性演变尚未系统阐明。迄今为止，仅零星报道了少数转化产物（如胍基脲、甲基双胍和2-氨基-4-甲基氨基-1,3,5-三嗪（2,4-AMT），整个厌氧转化网络和毒性动态仍大部分未知。第三，驱动厌氧二甲双胍生物转化的关键功能微生物和酶机制尚未明确，限制了针对性生物过程优化策略的发展。

在本研究中，我们使用AnMBR在逐渐增加的二甲双胍负荷条件下系统研究了厌氧二甲双胍生物降解过程。通过超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOF-MS/MS）和高性能液相色谱-串联质谱（HPLC-QQQ-MS）全面鉴定转化产物，并使用ADMETLab 3.0预测了它们的毒性演变。此外，通过整合宏基因组学和宏转录组学阐明了参与厌氧二甲双胍生物转化的关键功能微生物、代谢途径和活性表达基因。通过将化学转化动态与微生物功能过程联系起来，本研究为厌氧二甲双胍降解提供了新的机制见解，并为开发节能和低碳的二甲双胍污染水体生物修复策略奠定了科学基础。

章节摘录

化学品

盐酸二甲双胍（99%）、硫酸胍基脲（98%）和硫酸1,1-二甲基胍（98%）分别从北京Psaitong生物技术有限公司、上海Aladdin生物技术有限公司和上海YuanYe生物技术有限公司购买；色谱级乙腈来自上海ASTOON化学技术有限公司。所有其他化学品均符合分析级规格。

AnMBR的构建与长期运行

在本研究中，构建了一个AnMBR

AnMBR中的高效二甲双胍生物降解

通过长期运行AnMBR，在不同进水浓度下评估了二甲双胍的厌氧生物降解能力（图1）。在第一阶段（第0–40天），进水二甲双胍浓度为1.1 ± 0.1 mg/L时，稳态下的去除效率接近98.0 ± 1.0%。当进水二甲双胍浓度升高至5.3 ± 0.3 mg/L（第二阶段，第41–60天）时，去除效率立即下降至0–23.0%（第41–47天），但随后

CRediT作者贡献声明

王欣：撰写初稿、验证、方法学研究、数据分析、概念化。梁博军：验证、方法学研究、数据分析。吴丹妮：验证、方法学研究、数据分析。张学明：验证、方法学研究、数据分析。赵和平：撰写、审稿与编辑、资源协调。赖春宇：撰写、审稿与编辑、验证、项目管理、资金争取、概念化。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

我们感谢浙江大学生命科学学院的王勇教授在分子动力学模拟方面的帮助以及激发性的讨论。感谢中国国家重点研发计划（2024YFC3712500）、国家自然科学基金（52470061、U25A20583）、浙江省自然科学基金（LZ24E080003）、浙江省重点研发计划（2025C02214）以及创意研究科学基金的支持。