通过计算酶设计和途径工程，构建一种混合化学生物系统，以实现高效的新合成牛磺酸生产

《Bioresource Technology》：Engineering a hybrid chemical-biological system for efficient de novo taurine production via computational enzyme design and pathway engineering

通过整合路径工程、计算辅助的酶设计及化学-生物混合系统，在E. coli中构建了高效牛磺酸生物合成系统。采用序列导向酶挖掘筛选出HcCDO和AeCSAD的优良催化亚基，并通过物理化学计算优化获得活性提升3.19倍的AeCSAD(T410P/T498W)变体。建立过氧化氢驱动的温和氧化过程实现亚牛磺酸高效转化为牛磺酸，并协调碳硫代谢网络提升半胱氨酸前体供应。在连续补料发酵中实现4.08 g/L牛磺酸产量，创当前最高记录。

　　

李凌聪|李聪聪|陈亚楠|孙卓桐|曲戈|梁伟|刘俊

中国科学院天津工业生物技术研究所，中国天津300308

摘要

牛磺酸是一种重要的含硫非肽氨基酸，在食品、制药和饲料工业中得到广泛应用。微生物发酵已成为一种有前景的可持续替代方案，可以替代对环境不友好的化学合成方法来生产牛磺酸。然而，由于异源途径效率低下、关键酶活性不足以及前体供应有限，牛磺酸生产细胞工厂的发展仍然受到限制，导致牛磺酸产量较低。在这里，我们通过整合途径工程、酶设计和化学-生物混合系统，在大肠杆菌中建立了一个高效的从头合成牛磺酸的生物系统。为了构建高效的牛磺酸生物合成途径，我们进行了序列引导的酶挖掘，以鉴定出更优的HcCDO和AeCSAD催化剂。为了克服AeCSAD的催化瓶颈，我们采用了基于计算辅助的蛋白质工程方法，结合大规模蛋白质语言模型序列优化和基于物理的能量计算，得到了活性提高3.19倍的AeCSAD（T410P/T498W）变体。为了解决类似FMO1的酶溶解性差和活性低的问题，我们建立了一种温和的H?O?驱动的末端氧化过程，能够快速定量地将低牛磺酸转化为牛磺酸。同时，我们采用了多层次的代谢重编程策略，协调调节碳代谢和硫同化模块，从而增加了细胞内半胱氨酸的可用性，提高了牛磺酸的产量。通过将优化后的途径与发酵后的化学氧化过程结合在连续培养系统中，我们实现了4.08克/升的牛磺酸产量，这是迄今为止报道的最高产量。总体而言，我们的结果建立了一个机制上整合的化学-生物平台，用于从头合成牛磺酸，并为含磺酸化合物的可持续生产提供了一个通用框架。

引言

牛磺酸（2-氨基乙磺酸）是一种含硫的非蛋白质来源的β-氨基酸，在动物组织中含量丰富（Lambert等人，2014年）。在哺乳动物中，牛磺酸是可兴奋组织（包括大脑、视网膜和骨骼肌）中最丰富的游离氨基酸之一，这突显了其重要的生理作用（Jacobsen & Smith，1968年）。最近的研究表明，牛磺酸参与多种生理过程，包括膜稳定、Ca2?稳态、抗氧化防御、免疫调节和神经保护（Singh等人，2023年）。由于这些多效性，牛磺酸在食品、制药和饲料工业中得到广泛应用，尤其是在能量饮料、婴儿配方奶粉和富含植物蛋白的饲料中（Ripps & Shen，2012年）。随着健康意识和功能性营养需求的增加，预计全球牛磺酸市场将从2025年的约4.764亿美元增长到2035年的9.548亿美元，年增长率约为7.2%。

目前，工业牛磺酸主要通过从动物组织中提取或化学合成获得。从富含牛磺酸的材料（如家禽和贝类）中提取效率低下且难以标准化，而且所得产品可能含有抗生素或激素残留物，从而限制了其在食品和制药领域的应用（Liu等人，2020b）。因此，化学合成是牛磺酸生产的主要工业方法（Ma等人，2020年）。传统的化学合成路线通常依赖于石化前体、苛刻的反应剂和能耗高的单元操作，从而产生大量化学废物并引发环境问题（Bondareva等人，2008年）。相比之下，微生物发酵具有成本效益高、易于扩展且环保的优点，已被应用于多种分子的工业生产，包括氨基酸（Jin等人，2025年）、有机酸（Tian等人，2025年）和维生素（Zhao等人，2025年）。这些特点使得微生物牛磺酸发酵成为一种有吸引力的工业路线，并激发了对其发展的兴趣。然而，开发高性能的牛磺酸生产微生物细胞工厂的努力仍然有限。

动物体内的牛磺酸生物合成途径主要通过半胱氨酸亚砜途径实现。在这个途径中，l-半胱氨酸被半胱氨酸双加氧酶（CDO）氧化为半胱氨酸亚砜（CSA），然后由半胱氨酸亚砜脱羧酶（CSAD）脱羧生成低牛磺酸，最终由NADPH依赖的黄素单加氧酶1（FMO1）氧化为牛磺酸（McCoy等人，2006年；Veeravalli等人，2020年）。然而，大多数微生物缺乏内源性的牛磺酸生物合成途径，其代谢机制尚不清楚。在大肠杆菌等细菌中，牛磺酸主要在硫酸盐或l-半胱氨酸限制条件下通过TauABC转运系统和牛磺酸双加氧酶（TauD）作为硫源被分解（Nishikawa等人，2018年）。最近，人们尝试通过引入异源的动物牛磺酸生物合成途径来改造微生物以生产牛磺酸。Tevatia等人将鲤鱼的牛磺酸生物合成基因引入Reinhardtii衣藻，获得了0.14毫克/克的牛磺酸产量（Tevatia等人，2019年）。此外，Joo等人在谷氨酸棒状杆菌中构建了一个结合O-磷酸-l-丝氨酸和l-半胱氨酸途径的联合途径，积累了517毫克/升的牛磺酸（Joo等人，2018年）。尽管如此，牛磺酸的产量仍不足以满足工业生产的需求，这凸显了优化途径设计和宿主工程的必要性。

微生物高效牛磺酸生物合成受到几个关键挑战的限制。首先，典型的途径酶，特别是动物来源的CDO和CSAD，在微生物宿主中的活性低且表达不充分，从而限制了牛磺酸的代谢流量。其次，牛磺酸的生产依赖于充足的l-半胱氨酸前体，而其在微生物中的生物合成受到严格调控。例如，丝氨酸乙酰转移酶（CysE）是半胱氨酸合成的关键酶，会被细胞内的半胱氨酸强烈抑制，从而限制了前体池的流入（Johnson等人，2005年）。在我们之前的工作中，我们使用基于生物传感器的高通量进化策略获得了活性更高的CysE变体，但天然反馈抑制仍然存在（Gao等人，2022年）。第三，微生物中的牛磺酸生物合成与碳和硫代谢紧密耦合。这些模块之间的不平衡容易导致细胞毒性硫中间体（如硫酸盐和硫化物）的积累，从而损害细胞生长、扰乱氧化还原平衡并使代谢流偏离产物形成。因此，协调碳流和硫同化对于实现稳定的大规模生产至关重要（Yang等人，2023年）。最后，在微生物宿主体内重新构建低牛磺酸到牛磺酸的末端氧化过程仍然具有挑战性。动物体内的FMO1是一种NADPH依赖的、与膜相关的黄素蛋白，主要位于内质网中。其在细菌中的异源表达常常导致蛋白质错误折叠或聚集，活性显著降低。虽然低牛磺酸可以通过非酶促氧化途径转化为牛磺酸，但这一反应速度慢、可控性差且受条件影响大，从而限制了可获得的产量和过程的稳定性。

在这项研究中，我们在大肠杆菌中建立了一个化学-生物混合系统，用于高效从头合成牛磺酸（图1）。通过系统的酶筛选和对关键催化剂的合理蛋白质工程，我们建立了一条高效的牛磺酸合成途径。为了进一步强化代谢基础，我们通过精细调节碳和硫的流量，优化了半胱氨酸生物合成网络，从而增加了前体的可用性并稳定了牛磺酸的生物合成能力。为了克服末端氧化步骤的瓶颈，我们开发了一种基于过氧化氢的补充化学氧化过程，能够在温和、生物相容的条件下高效地将低牛磺酸转化为牛磺酸。最终，这个化学-生物混合系统被整合到连续培养系统中，实现了4.08克/升的牛磺酸浓度，这是迄今为止报道的最高产量。总体而言，这项工作展示了一种协同的化学-生物耦合策略，用于牛磺酸的生产，并为牛磺酸和其他含磺酸化合物的可持续生物合成提供了一种有吸引力和前景的方法。

菌株和培养条件

本研究中使用的所有菌株列于表S1中。E. coli Trans1-T1和E. coli BL21（DE3）分别用于质粒构建和蛋白质表达。E. coli JM109、E. coli BW25113和E. coli W3110被选为牛磺酸生产的宿主菌株。E. coli菌株在Luria-Bertani（LB）培养基（10克/升色氨酸、5克/升酵母提取物和10克/升NaCl）中培养。如有必要，可在培养基中添加50毫克/升卡那霉素、100毫克/升氨苄西林或30毫克/升氯霉素。

DNA操作

在大肠杆菌中构建和表征牛磺酸生物合成途径

为了构建生产牛磺酸的菌株，我们首先将异源的牛磺酸生物合成途径引入大肠杆菌。来自人类的半胱氨酸亚砜（CSA）途径是牛磺酸形成的最佳表征途径，因此被用作初始设计模板。因此，人类CSA途径的三个关键酶——半胱氨酸双加氧酶（CDO）、半胱氨酸亚砜脱羧酶（CSAD）和黄素单加氧酶1（FMO1）在大肠杆菌中共同表达

结论

在这项研究中，我们通过整合途径工程、计算辅助的关键酶设计和化学-生物混合策略，建立了一个高效的从头合成牛磺酸的生物系统。为了构建高效的牛磺酸生物合成途径，我们进行了序列引导的酶挖掘和合理设计，开发了强化的脱羧模块（AeCSAD（T410P/T498W）和优化的半胱氨酸氧化模块（HcCDO），从而实现了高效的转化

CRediT作者贡献声明

李凌聪：写作——审阅与编辑，撰写初稿，可视化，方法学，数据管理，概念化。李聪聪：写作——审阅与编辑，撰写初稿，可视化，方法学，数据管理，概念化。陈亚楠：可视化，软件，方法学。孙卓桐：监督。曲戈：可视化，软件，方法学。梁伟：写作——审阅与编辑，撰写初稿，概念化。刘俊：监督，资金提供

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了天津市自然科学基金（项目编号24JCZDJC00870、25JCZDJC00610、24JCZDJC00860）和中国国家自然科学基金（项目编号32570098和32572536）的支持。