通过定向进化改造枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中的丝氨酸蛋白酶LsPLAase，以实现高产分泌生产及高效降解聚乳酸（polylactic acid）的过程

《Bioresource Technology》：Directed evolution of a serine protease LsPLAase in Bacillus subtilis for high-yield secretory production and efficient depolymerization of polylactic acid

生物降解聚乳酸（PLA）的关键酶LsPLAase通过毕赤酵母分泌系统优化，结合发酵优化、定向进化和组合突变，显著提升产酶效率达321倍，催化活性较野生型提高70%，为工业级PLA废弃物回收提供 scalable 方案。

　　

程晓涛|吴磊|王文尧|吴婷|谢斌|严欣|董伟良|周杰|姜敏

中国南京工业大学生物技术与制药工程学院材料导向化学工程国家重点实验室，南京211800

摘要

聚乳酸（PLA）的生物可回收性受到其解聚酶生产能力不足和产率低的限制。无论是通过原始分离株Laceyella sacchari LP175的天然生产，还是使用大肠杆菌（Escherichia coli）系统制备，聚(l-乳酸）（PLLA）解聚酶LsPLAase，在工业应用中都受到复杂下游纯化步骤和有限蛋白质产量的制约。本研究基于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的分泌表达系统，经过发酵优化、定向进化、组合突变和高密度发酵，获得了无需纯化的LsPLAase变体LsPLAase^IWFI（A13I/S136W/S138F/W141I），其性能显著提升：在5升生物反应器中，蛋白质产率达到3.21克/升，酶活性达到6.7单位/毫升，相比野生型（0.9克/升，2.4单位/毫升）和大肠杆菌系统（0.01克/升，0.18单位/毫升）有显著改进。该变体在分解多种PLA材料方面的性能优于ProteinK，转化效率提高了70%。总体而言，本研究为PLA废物的工业化回收提供了可扩展的解决方案，有助于实现循环经济。

引言

传统塑料造成的环境污染引发了严重的生态危机，而可生物降解聚合物为解决塑料废物问题提供了有希望的替代方案（Kim等人，2023年；Rosenboom等人，2022年）。聚乳酸（PLA）是一种完全基于生物的热塑性聚酯，由可再生生物质中的乳酸合成（Datta和Henry，2006年；Guicherd等人，2024年）。利用其生物降解性和机械性能，PLA可以应用于包装、医疗、汽车、电子、纺织、农业和3D打印等多个领域（Shi等人，2024年；Zaaba和Jaafar，2020年）。尽管PLA具有生物降解性，但在常温条件下的降解速率较低，需要特定的温度和湿度条件进行工业堆肥处理（Guicherd等人，2024年）。

酶促解聚作为一种可持续策略，通过提高单体回收率或价值转化来减轻环境问题（Shi等人，2024年；Zaaba和Jaafar，2020年）。受聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）酶促回收技术的启发（Tournier等人，2020年），PLA的酶促回收技术也取得了显著进展，工程化的解聚酶如RPA1511-R5和ProteinT^FLTIER表现出优异的性能，在24小时内可实现超过85%的转化率（Guicherd等人，2024年；Xie等人，2024年）。然而，这些解聚酶依赖于大肠杆菌表达，导致纯化步骤复杂且酶产量低。LsPLAase是一种热稳定的PLLA解聚酶，属于丝氨酸蛋白酶，来源于嗜热放线菌L. sacchari LP175，能够以高达100克/升的底物浓度水解高分子量的PLA，为PLA的生物回收提供了另一种候选酶（Hanphakphoom等人，2014年；Lomthong等人，2019年）。然而，使用农业底物通过固态发酵（SSF）进行天然生产时，通常会伴随原始淀粉降解酶的共同表达，从而需要繁琐的纯化步骤（Lomthong等人，2017年；Lomthong等人，2015年；Lomthong等人，2018年；Lomthonga等人，2021年）。这些方法仍受限于酶产量低和催化效率不佳的问题（Lomthong等人，2019年）。

尽管塑料解聚酶具有巨大潜力，但其可扩展的生产仍然是一个重大挑战，因为这些酶具有强烈的疏水表面，导致蛋白质产量低和聚集倾向（Wu等人，2024年；Zhao等人，2026年）。为了提高产量，人们采用了多种异源表达系统；然而，使用毕赤酵母（Pichia pastoris）表达时，不必要的糖基化修饰会限制酶的产量和活性（Chen等人，2021年；Shirke等人，2018年）。在大肠杆菌中的异源表达虽然生长迅速且成本低，但由于纯化步骤复杂且容易形成包涵体，需要添加可溶性标签，从而增加了大规模生产的成本（Aer等人，2024年）。枯草芽孢杆菌中的分泌系统不仅能有效将蛋白质定向分泌到细胞外，还能避免酵母中的糖基化现象，使其成为生产保持天然结构的放线菌来源塑料解聚酶的理想宿主（Oh等人，2022年；Zhang等人，2020年）。

本研究通过将LsPLAase基因组整合到枯草芽孢杆菌SCK6中，并利用AprE信号肽实现无纯化分泌，通过发酵优化、定向进化和组合突变进一步改进了其性能，在5升发酵器中的酶产量达到了3.21克/升，是野生型的3.6倍，摇瓶培养的6.7倍，初始大肠杆菌系统的321倍。同时，其解聚效率比野生型提高了70%，在多种PLA材料上的转化效率比ProteinK提高了136–321%，为PLA废物管理提供了可扩展的平台，推动了循环经济的进展。所开发的分泌表达系统不仅促进了塑料解聚酶工程的高通量筛选研究，还为受大肠杆菌包涵体和酵母糖基化问题困扰的异源表达蛋白提供了宝贵见解。

媒体和试剂

所有分析级化学品均从中国Aladdin化学有限公司购买。Luria-Bertani（LB）培养基含有10克/升色氨酸、5克/升酵母提取物和10克/升NaCl。2×Super Rich（SR）培养基含有30克/升蛋白胨、50克/升酵母提取物和6克/升磷酸二氢钾（K₂HPO₄）（Fu等人，2018年）。ProteinK（EC 3.4.21.64，来自Tritirachium album）购自中国北京Takara公司（Oda等人，2000年）。乳酸标准品购自Sigma-Aldrich公司。

枯草芽孢杆菌与大肠杆菌中LsPLAase表达的比较

目前，从L. sacchari LP175（ADL09141）中制备PLA降解酶LsPLAase主要依靠固态发酵（SSF）和天然分离株，这通常伴随着原始淀粉降解酶的共同表达，从而增加了纯化的复杂性，阻碍了其工业化应用（Lomthong等人，2018年；Lomthonga等人，2021年）。在大肠杆菌中的异源表达主要会产生包涵体（见补充材料）。

结论

尽管近年来PLA解聚酶的研发取得了显著进展，但在催化性能和可扩展生产方面仍存在一些挑战。ProteinK作为基准酶，其解聚效率不足；工程化的ProteinT^FLTIER和RPA1511-R5虽然表现有所提高，但其表达依赖于大肠杆菌系统，酶产量仍不足以满足大规模生产的需要。本研究利用枯草芽孢杆菌的分泌系统实现了LsPLAase的生产。

CRediT作者贡献声明

程晓涛：撰写初稿、可视化、方法学设计、实验设计、概念构思。吴磊：方法学设计、实验设计。王文尧：撰写初稿、可视化、方法学设计、实验设计。吴婷：方法学设计、实验设计。谢斌：方法学设计、实验设计。严欣：方法学设计、实验设计。董伟良：项目监督、项目管理、资金申请。周杰：撰写与编辑、项目监督、项目管理、资金申请

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家重点研发计划（项目编号2024YFC3908300）、国家自然科学基金（项目编号22278219、U23A20126）以及江苏省基础研究计划（项目编号BT2025030、BK20250136、BK20233003）的资助。