基于噬菌体-抗免疫复合物肽和PCN-224@MXene的信号增强型超灵敏光电化学免疫传感器，用于检测黄曲霉素B1

《Biosensors and Bioelectronics》：Signal-enhanced ultrasensitive photoelectrochemical immunosensor for detecting Aflatoxin B1 based on phage-anti-immunocomplex peptide and PCN-224@MXene

本研究开发了一种基于噬菌体抗免疫复合肽和PCN-224@MXene复合材料的高灵敏度光电化学免疫传感器，用于检测玉米中的黄曲霉毒素B1（AFB1）。通过多信号放大策略，传感器检测限低至0.91 fg/mL，显著低于中国玉米法规限值（20 μg/kg），且具有优异的灵敏性、稳定性和重复性，适用于现场快速检测。

　　

宋文旭|曹新瑞|岳文迪|赵凤春|周青|杨正友

山东农业大学生命科学学院微生物学系，泰安271018，中国

摘要

黄曲霉素B1（AFB1）是一种致癌的霉菌毒素，在谷物中广泛存在。特别是由玉米制成的饲料和食品中AFB1的污染更为严重，这对食品安全和人类健康构成了严重威胁。因此，开发快速、灵敏且准确的AFB1检测方法具有重要意义。在本研究中，我们基于噬菌体-抗免疫复合物肽和PCN-224@MXene复合材料，开发了一种高灵敏度的光电化学（PEC）免疫传感器来检测AFB1。制备的噬菌体-抗免疫复合物肽能够与大量酶标记的二级抗体结合，从而大大提高了辣根过氧化物酶（HRP）的负载能力。此外，PCN-224@MXene具有更宽的光吸收范围和更窄的带隙，有助于提高光电转换效率。这使得PCN-224@MXene的光电流强度分别比PCN-224和MXene高出1.9倍和2.5倍。另外，HRP催化H₂O₂氧化4-氯-1-萘酚生成绝缘沉淀物，阻碍了光诱导的电子传输，从而导致光电流发生明显变化。通过多信号放大策略，PEC免疫传感器检测AFB1的灵敏度显著提高。在最佳检测条件下，线性范围为1 fg mL^-1至100 ng mL^-1，检测限低至0.91 fg mL^-1（3σ/S）。这一检测限远低于玉米中AFB1的监管限。该方法表现出良好的选择性、稳定性和重复性，可应用于玉米样品中AFB1的检测。

引言

黄曲霉素是一类由多种真菌产生的生物活性次级代谢产物，包括黄曲霉和寄生曲霉（Akullo等人，2025年）。黄曲霉素具有高毒性，在受霉菌污染的谷物中普遍存在，尤其是在玉米和花生样品中（Jallow等人，2021年；Shi等人，2018年）。玉米是一种重要的经济作物，在全球范围内广泛种植。自2010年以来，中国的玉米产量一直占全球总量的22%，主要用于饲料和食品加工（An等人，2022年）。然而，全球玉米中黄曲霉素的污染率约为45%（An等人，2022年）。当受污染的玉米被用作饲料时，黄曲霉素会在牲畜和家禽体内积累；这些毒素随后通过肉类、鸡蛋和牛奶等动物产品进入人类食物链，对人类健康构成潜在风险。因此，提高玉米及其加工产品中黄曲霉素污染的检测能力对于保护人类健康至关重要。在各种黄曲霉素中，AFB1分布最广、毒性最强、危害最大，即使在极低含量下也具有显著的生殖和致癌毒性（Rushing等人，2019年）。鉴于AFB1带来的严重风险，各国政府和组织制定了卫生标准和检测规定，规定了农产品和食品中AFB1的最大允许含量（Anfossi等人，2016年）。欧盟和中国对玉米中AFB1的监管限分别为2-12 μg kg^-1和20 μg kg^-1。为了有效预防和减少由黄曲霉素污染的农产品引起的疾病，迫切需要开发快速、高灵敏度的检测方法，以便及时识别受污染的食品并切断污染链（Jafari等人，2021年；Kumar等人，2017年）。目前，已经开发了多种AFB1检测方法，主要集中在高精度仪器分析上，如高效液相色谱（HPLC）和液相色谱-质谱（LC-MS）（Okechukwu等人，2024年）。但这些方法在应用上仍存在一些限制，包括设备昂贵且复杂、预处理过程繁琐耗时，以及需要专业操作人员（Magdalena Pisoschi等人，2023年）。基于此，电化学免疫测定法在检测食品中的小分子污染物方面逐渐显示出显著效率，因其具有响应速度快、操作简单和成本低等优点（Li等人，2023年；Yu等人，2025年）。此外，光电化学免疫测定法（PECIA）结合了光学激发和电化学检测，由于背景噪声较低，具有更高的灵敏度（Yang等人，2024年；Zhao等人，2015年；Chen等人，2026年）。

光电活性材料的升级和生物识别元件的设计是PECIA检测系统的两个关键因素（Zhou等人，2020年；Song等人，2026年）。在各种光电活性材料中，含金属的半导体被广泛利用，例如金属氧化物、金属硫化物和金属有机框架（MOFs），这是一种通过金属与有机配体配位合成的新型晶体多孔材料（Ma等人，2022年）。MOFs兼具金属节点和有机配体的优良化学性质，便于控制其光电活性并修改其表面，已应用于光电化学传感器中作为光活性材料（Li等人，2016年；Wei等人，2020年）。特别是，由于卟啉材料在太阳能电池领域的出色性能，基于卟啉的金属有机框架（如PCN-224）成为一种新型的光电活性材料，引起了广泛关注（Park等人，2020年；Zhou等人，2019年；Zhang等人，2025年）。

然而，MOFs的固有局限性，如导电性低和稳定性差，严重限制了其广泛应用（Olorunyomi等人，2024年）。为了利用MOFs的优势和功能材料的特性，提出了一种复合方法，结合MOFs和功能材料的优点，保留MOFs的特性同时利用功能组分的特性以实现互补性能（Zhuang等人，2023年）。MXene是一种二维过渡金属碳化物-氮化物材料，具有多种优异性能，包括金属导电性和亲水性，适合作为电极材料（Nasrin等人，2022年；Shahzad等人，2020年）。MXene的手风琴状纳米片结构和生物相容性为纳米颗粒和生物分子的负载提供了较大的表面积（Li等人，2025年）。此外，MXene的可调节层间间距为各种插层剂提供了足够的空间，有利于构建具有改进层叠结构的夹心结构（Yadav等人，2024年）。因此，MXene被认为是与MOFs复合优化的理想材料（Arab等人，2024年）。

生物传感器的灵敏度、特异性和稳定性从根本上取决于其生物探针元件的分子识别特性（Wang等人，2024年）。作为生物传感器的重要分支，免疫传感器的特异性和灵敏度依赖于抗体和抗原之间的特异性识别。理论上，非竞争性免疫测定法的灵敏度高于竞争性免疫测定法。然而，在检测霉菌毒素和农药等小分子污染物时，免疫传感器通常采用竞争性免疫测定法，主要是因为小分子污染物体积小且具有单一表位组成（Li等人，2021年）。最近，研究人员开发了针对免疫复合物的抗体或短肽，建立了能够检测小分子污染物的新型非竞争性免疫测定法（Li等人，2018年）。通过噬菌体展示技术开发的抗免疫复合物肽（AIcPs）被广泛用于小分子污染物的非竞争性分析。AIcPs可以通过噬菌体展示技术表达在M13噬菌体的N-末端外壳蛋白上，形成噬菌体-AIcPs。噬菌体-AIcPs不仅可以通过非竞争性免疫测定法增强对小分子污染物的灵敏度，还能与大量酶标记的抗M13二级抗体结合，从而大大提高辣根过氧化物酶（HRP）的负载能力，进一步改善检测灵敏度（Zhao等人，2025年）。

在本研究中，我们将光电活性物质PCN-224附着在MXene表面，制备了纳米复合材料（PCN-224@MXene），进一步提高了光电转换效率。MXene发挥了多重作用，为生物分子提供了有利的活性接触界面，扩展了光谱吸收范围，并提高了纳米复合材料的导电性。此外，制备的噬菌体-AIcP13能够特异性识别AFB1和Nb28纳米体（Zou等人，2022）的免疫复合物，能与大量酶标记的二级抗体结合，从而大大提高HRP的负载能力。另外，HRP催化H₂O₂氧化4-氯-1-萘酚（4-CN）生成绝缘沉淀物，阻碍了电极表面与电解质之间的电子传输。基于这些多重检测信号的增强，所提出的光电化学免疫传感器的灵敏度显著提高，可用于实际评估玉米样品中的AFB1。

材料与试剂

四（4-羧基苯基）卟啉（H₂TCPP）从TCI Development Co., Ltd（上海，中国）购买。氧化锆八水合物（ZrOCl₂·8H₂O）、苯甲酸、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和磺基琥珀酰亚胺4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯（Sulfo-SMCC）以及二甲基亚砜（DMSO）从Aladdin（上海，中国）购买。4-氯-1-萘酚（4-CN）从上海Macklin Biochemical Co., Ltd（上海，中国）获得。辣根过氧化物酶（HRP）

PCN-224@MXene的特性

通过SEM和TEM对制备的纳米材料的微观形态和尺寸进行了表征。如图1A所示，MXene表现出标准的多层手风琴状结构，赋予了高比表面积。获得的PCN-224呈现直径约为50 nm的纳米球形态（图1B和1D）。PCN-224@MXene的SEM和TEM图像（图1C和1E）显示，球形的PCN-224嵌入在MXene的层之间

结论

总之，PCN-224成功附着在MXene表面，作为光活性材料进行探索，并与噬菌体-AIcP13结合，提出了一种超灵敏检测AFB1的新策略。研究发现，MXene通过扩展光谱吸收范围和促进电子传输显著提高了光电转换效率。同时，MXene提供了丰富的抗体结合位点，这归因于其高比表面积和表面特性

CRediT作者贡献声明

曹新瑞：验证、研究、数据管理。宋文旭：撰写——初稿、验证、研究、正式分析、数据管理、概念构思。杨正友：撰写——审阅与编辑、监督、资源获取、项目管理、方法学、研究、资金获取、数据管理、概念构思。周青：撰写——审阅与编辑、监督、软件。赵凤春：监督、方法学、正式分析、数据管理。岳文迪：

未引用参考文献

Rushing和Selim，2019年；Wei等人，2025年；Xue等人，2024年；Zhou和Tang，2020年。

利益冲突声明

作者声明没有可能不当影响我们工作的财务和个人关系，也没有任何产品、服务及/或公司的专业或其他个人利益可能会影响本文所述内容或手稿的审阅。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（31901778和31772060）和山东省自然科学基金（ZR2021QB139）的支持。