《Blood Cells, Molecules, and Diseases》：Managing heavy menstrual bleeding in adolescents with bleeding disorders: Outcomes from a pragmatic LMIC approach
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本研究开发了重组VWF D’D3人血白蛋白融合蛋白（rD'D3-FP），旨在延长凝血因子VIII半衰期。通过体外细胞实验和动物模型，发现rD'D3-FP与STAB2在体外相互作用，但白蛋白融合可能通过抑制STAB2介导的内吞降解，并激活FcRn介导的循环重摄取，从而延长半衰期。但hFcRn转基因小鼠中效果有限，提示可能存在其他独立机制。
金·G·刘（Kim G. Lieu）| 萨宾·佩斯特尔（Sabine Pestel）| 马海丽·麦克斯韦尔（Mhairi Maxwell）| 刘宇涵（Yu-Han Liu）| 格雷格·T·巴斯（Greg T. Bass）| 戴云（Yun Dai）| 伊莎贝尔·格劳泽（Isabelle Glauser）| 马科·霍夫曼（Marco Hofmann）| 阿德里安娜·巴兹·莫雷利（Adriana Baz Morelli）| 蔡珍妮（Jenny Chia）| 安妮·M·维尔哈根（Anne M. Verhagen）
CSL Innovation Pty Ltd，澳大利亚维多利亚州帕克维尔
摘要
我们开发了一种重组VWF D’D3白蛋白融合蛋白（rD'D3-FP），旨在延长同时使用的凝血因子VIII（FVIII）的半衰期，以治疗A型血友病。我们研究了rD'D3与白蛋白融合对Stabilin-2（STAB2）清除受体通路的影响，以及通过新生儿Fc受体FcRn介导的rD'D3-FP再循环机制，这两种机制可能有助于延长rD'D3-FP的半衰期。利用表达STAB2的人293-F细胞或同时表达FcRn的细胞，通过流式细胞术和共聚焦显微镜观察了荧光标记的rD'D3-FP的结合和细胞内转运情况。此外，还在FVIII敲除（KO）小鼠、FcRn敲除（FcRn KO）小鼠和hFcRn Tg32转基因小鼠中评估了rD'D3-FP的药代动力学。研究表明，rD'D3-FP与其His标签标记的衍生物与STAB2的相互作用在中性pH条件下最为理想，但在酸性条件下会解离。虽然白蛋白融合似乎会阻碍rD'D3-FP与STAB2的结合，但在体外系统中仍观察到STAB2介导的rD'D3-FP内吞作用和溶酶体降解。通过共表达STAB2和FcRn，可以实现rD'D3-FP向Rab11+回收内体的转运。与仅表达His标签的rD'D3相比，rD'D3-FP的药代动力学显著改善；然而，在hFcRn Tg32小鼠中，rD'D3-FP的半衰期仅比FcRn KO小鼠或野生型小鼠略有延长。尽管FcRn在延长rD'D3-FP半衰期中可能起次要作用，但白蛋白融合可能会抑制其他清除机制。因此，我们提出了几种可能在不同物种中延长rD'D3-FP半衰期的独立机制。
引言
A型血友病（HA）是一种X连锁隐性遗传性出血性疾病，表现为凝血因子VIII（FVIII）功能异常或缺乏，其发病率约为每5000名男性新生儿中有1例[1]。在血管损伤部位，活化的FVIII（FVIIIa）与活化的因子IX（FIXa）结合形成内源性十酶复合物，从而激活因子X（FX），生成凝血酶并形成纤维蛋白凝块[2]。严重HA患者（血浆FVIII活性<1%）可能会出现频繁、自发的、无法控制的出血，尤其是关节出血，导致慢性关节病变和严重的身体残疾[1]。患者还会经历疼痛、不适、自我护理困难、焦虑和抑郁等问题，从而影响生活质量[3]。HA患者可以通过预防性或按需治疗进行替代FVIII疗法，包括输注血浆来源的FVIII（pdFVIII）或重组FVIII（rVIII）[1]。然而，pdFVIII和rVIII的半衰期相对较短（约12小时[4]），因此需要每周注射多次，并且由于促血栓形成的风险，剂量必须严格控制。大约25-35%的HA患者会发展出FVIII抑制剂[5],[6]，这需要采用替代疗法。一种新型疗法是双特异性单克隆抗体emicizumab，它可以绕过FVIII的作用机制[7],[8]。
在循环系统中，约98%的FVIII与VWF的D’D3结构域以紧密的非共价结合形式存在，这种结合将FVIII的半衰期延长至12小时，而缺乏VWF时半衰期仅为2小时[9],[10]。VWF通过保护FVIII免受蛋白酶降解、不受控制的激活以及与脂蛋白相关清除受体的相互作用，在维持FVIII稳定性和止血过程中起着关键作用[10],[11]。延长FVIII半衰期的方法包括使用一种新型重组融合蛋白rFVIIIFc-VWF-XTEN（BIVV001），该蛋白由VWF D’D3结构域与FVIII-Fc（FVIII与免疫球蛋白G的Fc部分）以及两个XTEN模块组成[12]。我们描述了一种重组VWF D’D3白蛋白融合蛋白（rD'D3-FP）及其变体，这些变体具有增强的FVIII结合能力，在多种动物模型中能够延长同时使用的重组单链B结构域缺失FVIII（rVIII-SingleChain）的半衰期[13],[14]。由于rD'D3-FP不含促血栓形成区域，其剂量可以高于血浆来源的VWF（pdVWF）或重组VWF（rVWF）[13]。然而，白蛋白融合对rD'D3-FP的清除和再循环以及半衰期延长的影响尚不完全清楚。
多项全基因组关联研究（GWAS）已经确定了与FVIII和/或VWF水平相关的清除受体基因，包括SCARA5（Scavenger受体A类，成员5）、STAB2（stabilin-2）、SIGLEC5（唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素5）和CLEC4M（C型凝集素结构域家族4，成员M）[15],[16],[17]。后续研究表明，这些清除受体参与血浆来源的VWF（pdVWF）的内吞和降解，从而可能影响VWF的半衰期[18],[19],[20],[21],[22]。其中，STAB2被认为在调节VWF/FVIII水平方面起主要作用，并参与对VWF/FVIII复合物的免疫反应[18]。
STAB2是一种H类清除受体，对于肝素、透明质酸、糖胺聚糖和磷脂酰丝氨酸等多阴离子分子的溶酶体降解和清除至关重要[23],[24],[25],[26],[27],[28]。STAB2是一种I型跨膜糖蛋白，存在两种主要异构体，具有相似的配体结合特性：(1) 315-kDa的异构体（315 kDa-STAB2）；(2) 190-kDa的异构体，后者是通过Ser^1136位点的蛋白酶切割产生的[29]。有趣的是，190 kDa-STAB2的表达水平是其全长形式的2倍[30]。它主要表达在肝脏、脾脏和淋巴窦内皮细胞上，前者被认为是VWF和FVIII清除的主要场所[31]。
在这里，我们发现rD'D3-FP与STAB2的相互作用是通过融合蛋白的D’D3部分介导的，这促进了其在体内的内吞和随后的溶酶体降解。然而，白蛋白融合似乎通过使rD'D3与同时表达FcRn和STAB2的细胞中的新生儿Fc受体FcRn结合，将rD'D3-FP导向内吞再循环途径。白蛋白融合还可能阻碍rD'D3-FP与STAB2的结合，从而影响其清除。因此，我们确定了两种可能在不同物种中延长rD'D3-FP半衰期的潜在机制。
重组蛋白的表达、纯化和标记
重组人血清白蛋白（rHSA）在人类FreeStyle? 293-F细胞（Life Technologies）中表达，并按先前描述的方法进行纯化[32]。重组蛋白rD'D3-FP、rVWF-FP和rD'D3-8His在中国仓鼠卵巢K1细胞中表达，并按先前描述的方法进行纯化[13]。rVIII-SingleChain（AFSTYLA?）由CSL Behring（马尔堡）提供。对于共聚焦成像实验，蛋白质被连接到Alexa Fluor? 488（AF488）（Life Technologies, A20181）或Alexa Fluor? 568（AF568）
STAB2介导rD'D3-FP的内吞
已有多种清除受体被证实参与pdVWF的清除，包括SCARA5[17],[19]、STAB2[15],[16]、SIGLEC5[22]、SIGLEC7[35]和CLEC4M[15],[16],[17],[18],[19],[20],[21],[22]。为了确定rD'D3-FP的潜在清除受体，将人类FreeStyle 293-F（293-F）细胞短暂转染以表达SIGLEC5、SIGLEC7、SCARA5、CLEC4M或STAB2的315 kDa异构体（315 kDa-STAB2），或转染为空白对照细胞。细胞裂解物的Western分析证实了...
讨论
我们之前描述了一种重组VWF D’D3白蛋白融合分子rD'D3-FP，在小鼠、大鼠、兔子和猕猴中的终末半衰期比pdVWF延长了8倍以上[13]。重要的是，rD'D3-FP与rVIII-SingleChain联合使用后，其终末半衰期比单独使用rVIII-SingleChain延长了4.3-5倍[13]，表明rD'D3-FP可能是治疗A型血友病的有希望的候选药物。在当前研究中，我们...
CRediT作者贡献声明
金·G·刘（Kim G. Lieu）：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、方法学、研究、数据分析、概念构思。
萨宾·佩斯特尔（Sabine Pestel）：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、方法学、研究、数据分析。
马海丽·麦克斯韦尔（Mhairi Maxwell）：方法学、研究、数据分析。
刘宇涵（Yu-Han Liu）：方法学、研究、数据分析。
格雷格·T·巴斯（Greg T. Bass）：数据分析。
戴云（Yun Dai）：研究。
伊莎贝尔·格劳泽（Isabelle Glauser）：研究。
马科·霍夫曼（Marco Hofmann）：研究。
阿德里安娜·巴兹（Adriana Baz）：
利益冲突声明
所有作者是CSL Pty Ltd的员工和/或股东。
致谢
我们感谢CSL Research的蛋白质表达和蛋白质生物化学团队在重组蛋白表达和纯化方面的支持；感谢Matthew P. Hardy在STAB2表达构建方面的帮助；感谢CSL Research的Shirley Taylor、SooSan Wan和Rajesh Ghai在重组蛋白荧光标记方面的协助；同时感谢墨尔本大学的生物光学显微镜平台在成像实验中的支持。
