《Cellular Signalling》：The lamin A/C-P4HB interaction axis regulates endoplasmic reticulum stress and apoptosis in myocardial ischemia-reperfusion injury via a calreticulin-associated mechanism
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心肌缺血再灌注损伤中，核层蛋白A/C与P4HB的相互作用及其调控机制研究。通过建立SD大鼠心肌缺血再灌注模型及原代 neonatal大鼠心室肌细胞OGD/R模型，发现lamin A/C敲低可抑制P4HB核定位、缓解内质网应激和细胞凋亡。蛋白互作分析表明P4HB与lamin A/C存在物理结合，其动态平衡可能由钙调蛋白介导。该研究首次揭示lamin A/C通过调控P4HB分布影响心肌缺血再灌注损伤的分子机制。
Jiahui Zhou|Xinzhong Li|Na Li|Min Wang|Guibo Sun
药用植物研究，北京协和医学院与中国医学科学院，北京 100193，中华人民共和国
摘要
内质网应激（ERS）和凋亡是心肌缺血-再灌注损伤（MIRI）的标志性病理特征。Lamin A/C是一种与心脏疾病相关的核层蛋白，已被证实参与ERS和凋亡的调控，但其在MIRI中的作用仍不明确。同时，P4HB是一种与ERS相关的伴侣蛋白，可能通过与lamin A/C相互作用来调节MIRI的进展。我们假设lamin A/C与P4HB相互作用以调节MIRI的进程。我们评估了MIRISD大鼠心脏以及氧糖剥夺/再氧合（OGD/R）处理的原代新生大鼠心室肌细胞（PNRCMs）中P4HB和lamin A/C的分布情况。通过敲低lamin A/C的表达，我们研究了lamin A/C对OGD/R模型诱导的P4HB分布、ERS和凋亡的影响。利用STRING网络分析和蛋白质-蛋白质对接技术预测了lamin A/C/P4HB相互作用的分子基础。结果表明，OGD/R处理引发了PNRCMs中的P4HB向核膜内的转移、ERS激活和凋亡，而这些效应在敲低lamin A/C后得到了减弱。在正常和MIRI条件下均观察到了lamin A/C与P4HB之间的物理相互作用。P4HB–lamin A/C的相互作用可能受到calreticulin的动态调节。总体而言，我们的发现表明lamin A/C通过一种可能的calreticulin介导的动态机制来调节P4HB，从而减轻OGD/R诱导的ERS和凋亡。
引言
根据2024年世界卫生组织的报告[1]，缺血性心脏病仍然是全球主要的死亡原因，占所有死亡人数的13%。再血管化策略（包括溶栓、经皮冠状动脉介入和冠状动脉旁路移植）可以恢复冠状动脉灌注，但反而会引发心肌缺血-再灌注损伤（MIRI）[2]。缺血性和药物预处理仍然是旨在减轻MIRI的主要临床方法；然而，越来越多的证据表明这两种方法并未显著改善患者的预后[3]。数十年的研究仍未解决这些疗法的适用性、安全性和有效性方面的实际问题，这凸显了阐明其潜在分子机制的迫切需求[4]。
凋亡是MIRI的主要病理反应，也是梗死区域内心肌细胞丢失的主要驱动因素，直接决定了梗死的最终大小[5]、[6]。实验性抑制凋亡可以显著减轻MIRI的严重程度[7]、[8]，这突显了抗凋亡干预在减轻再灌注损伤中的重要性[9]。
Lamin A/C是核层的主要组成部分，它维持核的机械完整性，并协调染色质组织和基因表达[10]。失调的lamin A/C与心脏病理密切相关，表现为扩张型心肌病、致心律失常性心肌病和传导系统缺陷[11]、[12]。在凋亡过程中，caspase-6介导的lamin A/C切割会破坏核层，导致核膜破裂和细胞死亡的不可逆进程[13]。LMNA基因编码lamin A/C，人类中的致病性LMNA变异常导致恶性心律失常、扩张型心肌病和进行性传导疾病[14]、[15]、[16]。这些突变还会引发过度的内质网应激（ERS）和下游的凋亡[17]。在携带LMNA R321X变异的心肌细胞中，药物调节未折叠蛋白反应可以有效降低ERS并恢复蛋白质稳态[18]。
尽管lamin A/C对MIRI的贡献尚未得到充分研究，但LMNA突变与MIRI相关并发症的关联表明，lamin A/C可能是MIRI发病机制的关键因素——可能通过调节ERS和凋亡信号通路来实现。
ERS是MIRI的主要致病因素，而ERS介导的凋亡级联反应被认为是心肌细胞死亡的主要原因[19]。蛋白质二硫键异构酶（P4HB；也称为prolyl 4-hydroxylase亚基beta）是一种驻留在内质网中的伴侣蛋白，它参与新生多肽的折叠并调节氧化应激反应；因此，其表达水平可以作为ERS的定量指标[20]。在MIRI期间，持续的ERS会激活未折叠蛋白反应，当这种适应性机制失效时，促凋亡信号通路会被激活。P4HB通过维持蛋白质稳态来减轻不适当的ERS，从而限制再灌注心肌中的心肌细胞凋亡[21]。鉴于P4HB在ERS调节中的核心作用，探讨其可能与lamin A/C之间的物理或功能相互作用具有重要的科学价值。
基于上述研究，我们假设lamin A/C可能调节MIRI中的ERS和凋亡，并且这种调节作用可能与P4HB蛋白有关。为了验证这一假设，我们在MIRI SD大鼠模型和氧糖剥夺/再氧合（OGD/R）诱导的原代新生大鼠心室肌细胞（PNRCMs）中研究了lamin A/C与P4HB之间的相互作用。此外，我们还研究了lamin A/C表达对OGD/R模型中P4HB表达以及ERS和凋亡水平的影响。通过揭示lamin A/C与P4HB之间具体的分子机制，我们旨在进一步阐明MIRI的机制，并为开发针对性治疗策略提供有价值的见解。
部分内容摘录
心肌中P4HB-Lamin A/C相互作用的鉴定
我们首先在SD大鼠中建立了MIRI模型。24小时再灌注后进行了Evans Blue/TTC染色。染色结果显示MIRI引发了明显的心肌梗死（图1A）。通过HE染色进行的组织病理学检查显示了典型的MIRI诱导的心肌损伤，包括组织破坏和炎症浸润（图1B）。TUNEL染色用于检测心肌细胞凋亡，结果表明MIRI显著增加了...
讨论
本研究首次证明了大鼠心脏中lamin A/C与P4HB的共定位和Co-IP关联。通过检测PNRCMs中lamin A/C和P4HB的亚细胞分布，我们发现OGD/R损伤会导致P4HB在核膜内的积聚。此外，敲低lamin A/C可以逆转OGD/R诱导的P4HB在核周的定位、ERS和凋亡的激活。值得注意的是，我们的发现表明P4HB与lamin A/C之间的相互作用可能是通过...
试剂
Evans Blue（#E2129）和2,3,5-三苯基四氮唑氯（TTC）（#T8877）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。本研究中使用的封闭溶液（#ZLI-9556）由ZSGB-BIO（中国北京）提供。TdT介导的dUTP末端标记（TUNEL）染色试剂盒（#C0189）、QuickBlock封闭缓冲液（#P0252）和核及细胞质蛋白提取试剂盒（#P0028）购自Beyotime（中国上海）。用于细胞提取的胶原酶II（#V900892）由...CRediT作者贡献声明
Jiahui Zhou：撰写 – 审稿与编辑，撰写原始草稿，验证，实验设计，数据分析。Xinzhong Li：验证，方法学设计，实验实施。Na Li：数据可视化，软件应用。Min Wang：项目监督，数据管理，概念框架构建。Guibo Sun：资金获取，概念构思。
资助
本研究得到了国家重点研发计划（编号：2023YFD2201802）的资助。
