穿心莲内酯通过干扰β-TrCP介导的ATF4泛素化及降解过程，触发塞尔托利细胞（Sertoli Cells）中的铁死亡（ferroptosis），从而导致睾丸损伤

《Chemico-Biological Interactions》：Andrographolide induces testicular damage by triggering ferroptosis in Sertoli Cells via disruption of β-TrCP-mediated ATF4 ubiquitination and degradation

Andrographolide（Andro）可致小鼠睾丸损伤，机制为抑制β-TrCP介导的ATF4泛素化降解，激活Sertoli细胞铁死亡，破坏血睾屏障，最终导致生精功能障碍。通过RT-qPCR、Western blot及分子模拟验证Andro-β-TrCP直接相互作用，并证实铁死亡抑制剂deferoxamine可逆转损伤。

　　

Jiaqi Li|Zhengxin Lu|Nan Zhang|Xiaowei Zhou|Yuanbiao Ma|Jia-qi Li|Yimu Zhang|Zhewen Deng|Na Lin|Peng Yue|Yilin Yang|Qi Zhang|Bo Ma

南京工业大学药学院，中国南京 210009

摘要

穿心莲内酯（Andro）是穿心莲的主要生物活性成分，具有已知的生物活性，但也具有男性生殖毒性，其机制尚不明确。本研究探讨了其对睾丸的损伤作用及其机制，重点关注塞托利细胞（Sertoli cells, SCs）的铁死亡（ferroptosis）。在小鼠和塞托利细胞中评估了毒性，并通过RT-qPCR、Western blot、共免疫沉淀和泛素化实验探究了相关机制。LC-MS/MS技术用于分析组织分布。分子对接和动力学模拟研究了穿心莲内酯与β-TrCP的相互作用。结果表明，穿心莲内酯暴露会导致小鼠睾丸萎缩、血睾屏障（blood-testis barrier, BTB）破坏以及精子发生障碍。药代动力学分析显示，塞托利细胞是穿心莲内酯诱导的睾丸损伤的主要靶点，其积累迅速，并随后在精子和附睾中被检测到。此外，穿心莲内酯可触发塞托利细胞的铁死亡，表现为活性氧（ROS）增加、丙二醛（MDA）升高、铁过载和脂质过氧化。这些效应可通过铁死亡抑制剂去铁胺（deferoxamine）得到缓解。机制上，穿心莲内酯直接结合β-TrCP，抑制其表达并通过干扰其泛素介导的降解来稳定ATF4。沉默ATF4可抑制铁死亡并恢复细胞活力。分子对接、动力学模拟和CETSA实验均证实了穿心莲内酯与β-TrCP的直接相互作用。本研究揭示了穿心莲内酯通过抑制β-TrCP介导的ATF4泛素化和降解来触发塞托利细胞的铁死亡，从而导致血睾屏障破坏和精子发生障碍。这些发现为未来优化穿心莲内酯的临床应用提供了理论基础。

引言

穿心莲（Andrographis paniculata）在中国被称为“川心莲”，是一种具有千年药用历史的传统药用植物，在印度、斯里兰卡、中国和东南亚广泛使用[1]。穿心莲内酯（Andro）是该植物的主要成分之一，具有广泛的生物活性，传统上用于治疗发热、感冒、咽喉痛和腹泻。在现代应用中，它显示出对抗癌症、糖尿病、细菌和病毒感染（包括SARS-CoV-2和HBV）的治疗潜力[2]、[3]、[4]、[5]。不幸的是，基于穿心莲的内服中药逐渐显现出的生殖毒性限制了其临床应用，尤其是在长期服用或高剂量治疗时。先前的研究表明，穿心莲内酯会通过干扰精子发生过程在大鼠中引起男性生殖毒性——表现为精子数量和活力下降[6]。此外，穿心莲内酯还被用于少精子动物模型中进行药物筛选和评估[7]。然而，穿心莲内酯诱导的男性生殖毒性的精确分子机制仍不明确，这突显了进行系统毒理学研究的迫切需求。

铁死亡是一种依赖铁的调控性细胞死亡形式，其特征是铁过载、脂质过氧化、线粒体损伤和谷胱甘肽过氧化物酶耗竭[8]。近年来，男性生殖系统中的铁死亡受到了广泛关注。睾丸组织中铁代谢失衡与精子生成受损和男性不育有关[9]。最新证据表明，铁死亡激活可能在睾丸毒性中起重要作用。环境污染物（双酚A、镉、砷）、化疗药物博来霉素（Busulfan）和霉菌毒素玉米赤霉烯酮（Zearalenone）的暴露与男性生殖系统的铁死亡有关[10]、[11]、[12]。此外，三棱针（Tripterygium wilfordii）中的生物活性成分三棱内酯（Triptolide）可通过泛素化和降解GPX4（一种关键调节蛋白）来触发精子细胞的铁死亡，从而导致精子发生功能障碍[13]。此外，郑等人的研究表明，PM2.5引起的男性生殖系统损伤与铁死亡密切相关，同时伴有血睾屏障破坏和相关蛋白减少[14]。然而，穿心莲内酯诱导的睾丸损伤是否与铁死亡有关仍有待研究。

激活转录因子4（ATF4）是一种多功能转录调节因子，在多种哺乳动物细胞类型中普遍表达。ATF4在介导细胞对各种刺激的反应中起关键作用，包括环境压力、细胞内扰动和生长因子[15]。张等人发现，激活PERK-eIF2α-ATF4通路会显著降低塞托利细胞的活力，破坏血睾屏障并诱导细胞凋亡。此外，Bip-ATF4-CHOP信号通路可以缓解内质网应激，从而改善顺铂引起的睾丸损伤。ATF4在铁死亡中具有双重作用，其功能受应激类型、表观遗传修饰和相互作用蛋白的精细调控。何等人证明，ATF4直接结合SLC7A11启动子，促进半胱氨酸吸收和GSH合成，从而抑制脂质过氧化和铁死亡[16]。Debasmita Mukherjee等人显示，番茄红素（Tomatine）可抑制ATF4向细胞核的转运，触发其与基因启动子的结合，从而下调p-4EBP1并上调CHAC1，诱导铁死亡[17]。相反，在APAP诱导的肝毒性中，ATF4作为连接内质网应激和铁死亡的中心介质，通过PERK-eIF2α轴激活DDIT4，驱动mTORC1抑制并执行细胞死亡[18]。尽管ATF4在男性生殖生理中的作用尚未完全阐明，其在穿心莲内酯诱导的睾丸毒性中的作用也不清楚。基于上述研究，我们假设穿心莲内酯通过ATF4依赖的铁死亡途径损害塞托利细胞功能并破坏血睾屏障的完整性，最终干扰小鼠的精子发生。

在本研究中，我们首先证实穿心莲内酯可引起小鼠睾丸损伤和铁死亡，药代动力学分析显示其在塞托利细胞中特异性积累。机制研究表明，穿心莲内酯通过直接抑制E3泛素连接酶β-TrCP起作用，后者通过干扰ATF4的泛素-蛋白酶体降解来稳定ATF4，从而引发铁死亡。通过分子对接、分子动力学模拟和细胞热位移测定（CETSA）验证了穿心莲内酯与β-TrCP的特异性相互作用。这些发现为优化穿心莲内酯的临床安全性提供了重要见解，并指导其未来的药理学开发。

化学试剂

穿心莲内酯（纯度>98%）、3-甲基腺嘌呤（3-MA）、氯喹（CQ）、环己酰亚胺（CHX）和MG132购自Aladdin（中国上海）。丙二醛（MDA）检测试剂盒来自南京建城生物工程研究所（中国南京）。谷胱甘肽（GSH）含量检测试剂盒、DAB和亚铁离子含量检测试剂盒来自Solarbio（中国北京）。Ferrostatin-1（FER-1）、去铁胺（DFO）、雷帕霉素（Rapa）和RSL3购自Macklin（上海）。

穿心莲内酯导致小鼠睾丸损伤和精子发生功能障碍

为了评估穿心莲内酯对男性生殖系统的潜在生殖毒性及其机制，成年雄性小鼠腹腔注射不同剂量的穿心莲内酯（37.5、75和150 mg/kg）。实验时间线如图1A所示。暴露14天后，睾丸体积（图1B）和指数（图1C）与对照组相比呈剂量依赖性下降，而体重未见显著变化（图1D）。H&E染色显示...

讨论

男性不育是一个重要的公共卫生问题。药物对男性生殖的不良反应往往没有得到充分考虑、识别和研究[20]。穿心莲这种热带药用植物具有抗菌、抗氧化、抗糖尿病和抗炎等药理活性[21]、[22]、[23]。值得注意的是，先前的研究报道其通过抑制精子发生过程具有避孕作用...

结论

总之，我们的研究首次证明穿心莲内酯直接结合E3泛素连接酶β-TrCP，抑制其生理功能及其后续的ATF4泛素化和蛋白酶体降解，从而诱导塞托利细胞的铁死亡，进一步引发铁过载和脂质过氧化级联反应。这种ATF4介导的失调破坏了塞托利细胞的细胞结构，破坏了血睾屏障的完整性，最终导致穿心莲内酯诱导的生殖毒性（图9）。这些发现...

利益冲突声明

作者声明没有可能影响本研究的竞争性财务利益或个人关系。

作者贡献声明

Jia-qi Li：正式分析。Yuanbiao Ma：数据可视化。Xiaowei Zhou：正式分析、数据管理。Nan Zhang：正式分析、数据管理。Bo Ma：写作-审稿与编辑、监督、资源管理、项目管理、方法学、资金获取、概念构思。Zhengxin Lu：数据可视化、软件使用、方法学、实验设计。Qi Zhang：监督、资源管理、项目管理、资金获取。Jiaqi Li：写作-初稿撰写、数据可视化、验证、软件使用。

利益冲突声明

√作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了江苏省药品监督管理局的药品监管科学研究计划（编号202406）的支持。