雄激素受体–NOX4–坏死性凋亡轴在马兜铃酸诱导的急性肾损伤中驱动了男性偏高的易感性

《Chemico-Biological Interactions》：Androgen receptor–NOX4–necroptosis axis drives male-biased susceptibility in aristolochic acid-induced acute kidney injury

急性肾损伤（AKI）中性别差异的机制研究：雄烷受体-NOX4-坏死轴在AAI诱导的男性偏倚肾损伤中的作用。摘要：通过四个性别分化的AKI模型（AAI、顺铂、缺血再灌注、脓毒症），发现AAI诱导的AKI在男性中肾损伤更严重，机制涉及雄烷受体（AR）信号通路激活NOX4，通过RIPK1/RIPK3/p-MLKL途径引发坏死。抑制该通路（如Nec-1s）可缓解损伤，而AR拮抗剂（如比卡鲁胺）能逆转肾损伤，提示AR/NOX4轴是靶向治疗的新方向。

　　

王浩杰|王宇|连文飞|严民波|邱俊良|赵泽毅|李志伟|王勇|Yashpal S. Kanwar|戴英波|郑小平

中国广东省珠海市中山大学第五附属医院泌尿科

摘要

急性肾损伤（AKI）影响全球数百万患者，其常见原因包括多种肾毒素，其中 Aristolochic acid I（AAI）是主要致病因素之一。尽管性别差异在 AKI 中的作用越来越受到重视，但 AAI 诱导的损伤机制仍不明确。本研究通过四种基于性别的 AKI 模型（AAI 肾毒性、顺铂肾毒性、缺血-再灌注损伤和脓毒症相关 AKI）发现，AAI 诱导的 AKI 显示出最明显的性别差异，即男性患者往往出现更严重的肾损伤。在 HK-2 细胞中，100 μM 的 AAI 会引发显著的细胞毒性和 RIPK1/RIPK3/p-MLKL 凋亡通路的激活，而使用 10 μM 的凋亡抑制剂 Nec-1s 可抑制这一过程。在体内实验中，每天腹腔注射 5 mg/kg 的 AAI 5 天后，雄性小鼠的肾小管损伤、肾功能障碍和凋亡反应明显重于雌性小鼠；而每天腹腔注射 1.65 mg/kg 的 Nec-1s 则部分恢复了肾结构和功能。多组学分析、组织学研究和功能实验表明，雄性偏好的损伤机制与雄激素受体（AR）信号通路有关。AAI 暴露后 AR 在肾近端小管中表达增强，通过药物阻断 AR（bicalutamide，10 μM）可恢复细胞活力，并在体内（20 mg/kg，每日一次）缓解 AAI 诱导的 AKI，同时抑制凋亡信号通路。这些发现揭示了 AR–NOX4–凋亡轴在男性 AAI 诱导 AKI 中的致病作用，提示 AR 信号通路和 NOX4 介导的氧化应激可能是潜在的治疗靶点。

引言

急性肾损伤（AKI）是一种临床疾病，表现为肾功能急剧下降，每年影响全球约 1300 万人。其在住院患者中的发病率介于 7% 至 18% 之间，在重症患者中则超过 50% [1]。AKI 的原因多种多样，包括药物毒性、脓毒症和缺血-再灌注损伤等 [2]。一项涉及 65 万中国患者的大型多中心研究显示，近 40% 的 AKI 由药物引起，其中草药相关性肾毒性约占 16% [3]。

Aristolochic acid（AA）是一种天然存在于马兜铃属（Aristolochia）和细辛属（Asarum）植物中的硝基菲羧酸，常用于传统中药中，用于治疗关节炎、痛风和风湿病。其主要成分 Aristolochic acid I（AAI）是一种强效肾毒素，可导致进行性肾损伤，称为马兜铃酸肾病（AAN）[4]。早在 1964 年，中国文献中就首次报道了患者因摄入 AAI 而发生急性肾衰竭的病例，但当时尚未认识到其毒性。后续研究证实 AAI 是巴尔干地区地方性肾病的致病因子，确立了 AAI 暴露与 AAN 之间的直接关联 [5]。流行病学调查显示，约 1.5% 的中国成年人长期接触含 AAI 的草药产品 [6]，这凸显了阐明其致病机制和寻找治疗方法的紧迫性。

在多种类型的 AKI 中，性别对肾损伤的敏感性存在差异。实验和临床数据一致表明，男性比女性更容易发生缺血-再灌注损伤、脓毒症相关损伤和药物诱导的肾损伤 [7]。然而，关于 AAN（尤其是 AAI 诱导损伤的急性期）的性别差异研究仍有限。在四种 AKI 模型（缺血-再灌注、脓毒症、顺铂肾毒性和 AAI 暴露）中，雄性小鼠的肾损伤始终更为严重，尤其是在 AAI 诱导的 AKI 中差异最为明显。在相同剂量下，雄性小鼠的肾小管出现广泛坏死，而雌性小鼠的肾损伤较轻，显示出几乎二分化的损伤程度。这一实验结果与 Shi 等人的临床观察一致，他们发现急性 AAN 主要发生在男性患者中（男女比例约为 4:1），且这些患者比女性患者更早需要透析 [8]。

AAN 的发病机制涉及复杂的分子和细胞过程，其中肾小管上皮损伤是关键环节 [9]。肾小管作为实质组织的主要组成部分和 AAI 毒性的主要靶标，会经历多种形式的细胞死亡 [4,10]。其中，凋亡（necroptosis）是一种非凋亡性的程序性死亡方式。凋亡由受体相互作用蛋白激酶 1（RIPK1）和 3（RIPK3）以及混合谱系激酶结构域蛋白（MLKL）的协同激活介导。这些分子形成凋亡小体复合体，RIPK1 和 RIPK3 之间发生相互磷酸化，导致 MLKL 激活。磷酸化的 MLKL 移位到细胞膜上形成孔结构，最终导致细胞破裂和炎症性细胞死亡 [11-15]。凋亡已被证实与多种类型的 AKI（包括缺血性、毒性和炎症性损伤）相关 [16,17]。

生物信息学分析和体外实验表明，AAI 暴露会显著上调肾小管上皮细胞中的凋亡相关因子（如 RIPK1、RIPK3 和 MLKL）。使用 Necrostatin-1s（Nec-1s）抑制凋亡可部分恢复细胞活力，说明凋亡在 AAI 诱导的细胞毒性中起关键作用。此外，新证据表明，细胞死亡途径的性别差异可能是性别差异的原因之一。Shintaro 等人发现，铁死亡（ferroptosis）的性别差异也是缺血-再灌注诱导 AKI 中性别差异的原因之一 [18]。我们的研究也发现，AAI 处理后的雌性小鼠凋亡标志物显著低于雄性，提示雌性可能具有天然的凋亡保护机制。

基于这些发现，我们推测性激素（尤其是雄激素和雄激素受体（AR）信号通路）调节凋亡过程，从而影响急性 AAN 的性别差异。因此，本研究采用综合生物信息学分析和体外/体内模型，探讨凋亡在 AAI 诱导的肾损伤中的作用，并阐明 AR 信号通路调控凋亡的分子机制。这些发现为开发针对 AAI 诱导的 AKI 的靶向治疗措施提供了理论基础。

实验部分

HK-2 细胞实验

HK-2 细胞是一种永生化的人类近端肾小管上皮细胞系（购自 American Type Culture Collection，目录号 CRL-2190），培养于含有 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素（Gibco）的 DMEM/F12 培养基（Gibco，目录号 11330032）中。细胞在 37°C、5% CO₂ 的潮湿培养箱中培养。实验时，每孔接种 1 × 10³ 个细胞。用于凋亡研究的细胞...

AAI 诱导的急性肾损伤在小鼠中表现出明显的性别差异

为验证 AAI 肾毒性是否存在最显著的性别差异，我们在雄性和雌性 C57BL/6 小鼠中诱导了 AAI 诱导的 AKI。同时也在其他基于性别的 AKI 模型（顺铂肾毒性、缺血-再灌注损伤和脓毒症相关 AKI）中观察了性别差异。组织病理学结果显示，雄性小鼠的损伤更为严重；因此选择 AAI 模型进行后续的机制分析（见补充图 S1）。

讨论

本研究确定了最具性别差异的 AKI 模型，为研究急性 AAN 的性别差异提供了有力工具。我们发现 AAI 引发的性别差异最为明显：雄性小鼠出现广泛的肾小管坏死、大量管型形成和更严重的肾功能障碍，而雌性小鼠的损伤较轻。从单细胞和转录组整体水平来看...

CRediT 作者贡献声明

王浩杰：撰写初稿、数据可视化、方法设计、概念构建。王宇：数据可视化、方法设计、实验设计、数据整理。连文飞：方法设计、实验设计、数据整理。严民波：方法设计、实验设计、数据整理。邱俊良：数据可视化、方法设计。赵泽毅：数据分析。李志伟：软件开发。王勇：数据整理。Yashpal S. Kanwar：撰写、审稿与编辑、指导。戴英波：撰写、审稿与编辑。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢 BioRender.com 提供图形摘要，以及 http://www.humphreyslab.com/SingleCell/ 提供的 scRNA-seq 数据。本研究得到了中国广东省自然科学基金（项目编号：2019A1515012116）的资助。