环磷酰胺诱导的铁稳态失衡通过卵泡颗粒细胞的铁死亡（ferroptosis）机制，触发卵巢毒性，并涉及线粒体自噬（mitophagy）的相互作用

《Chemico-Biological Interactions》：Cyclophosphamide-induced iron homeostasis imbalance triggers ovarian toxicity through ferroptosis of ovarian granulosa cells in a mitophagy crosstalk manner

化疗药物环磷酰胺通过铁稳态失调和线粒体自噬介导的ferroptosis损伤卵巢颗粒细胞，调控铁代谢及抑制线粒体自噬可减轻损伤，为化疗卵巢毒性提供新机制。

　　

作者：徐波、罗晓强、何腾蛟、邓宇、尚一彤、韩航、傅旭峰

单位：教育部生育保存与维护重点实验室、宁夏回族自治区生殖与遗传学重点实验室、宁夏医科大学基础医学院，中国银川750004

摘要

化疗在有效杀死癌细胞的同时，往往会损害具有高增殖能力的正常细胞，从而导致医源性卵巢损伤。铁死亡（Ferroptosis）被认为是化疗药物引起卵巢损伤的关键机制。然而，其背后的分子机制尚未完全阐明。因此，本研究旨在探讨化疗药物通过铁死亡诱导卵巢损伤的机制。我们的研究发现，化疗药物环磷酰胺（CTX）会损害卵巢功能并干扰卵泡发育。进一步分析显示，在CTX诱导的闭锁卵泡颗粒细胞（GCs）中出现了铁死亡的特征性表现，包括Fe²⁺积累增加、脂质过氧化增强以及关键铁死亡相关分子的失调。体外实验表明，铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）可显著减轻CTX对KGN细胞的毒性作用。此外，通过使用铁螯合剂去铁胺（DFO）和铁补充剂柠檬酸铁铵（FAC），我们发现调节铁稳态可以减轻或加重CTX诱导的GCs中的铁死亡，从而证实铁稳态失衡是CTX诱导GCs铁死亡的主要诱因。值得注意的是，Fe²⁺的积累发生在线粒体内，并随后引发了过度的线粒体自噬，这种增强的线粒体自噬反应加剧了线粒体损伤，形成了一个持续的线粒体损伤恶性循环，最终使GCs对铁死亡更加敏感。相反，线粒体自噬抑制剂环孢素A（CSA）可减轻CTX诱导的GCs中的铁死亡。总之，本研究揭示了线粒体介导的铁死亡是CTX诱导卵巢损伤的关键机制。这些发现表明，针对线粒体自噬或铁死亡的治疗策略有望用于治疗和预防化疗相关的卵巢毒性。

引言

卵巢癌（OC）是最致命的妇科恶性肿瘤，2022年全球新发病例为324,938例，死亡病例为206,834例[1]。化疗是多种癌症的主要治疗方法；然而，化疗药物在杀死肿瘤的同时也会影响卵巢，可能导致医源性卵巢功能衰竭，临床表现为早发性卵巢功能衰竭（POF）和不孕[2]。环磷酰胺（CTX）被广泛认为是最具生殖毒性的化疗药物，会对所有年龄段女性的卵巢功能产生负面影响[3]。先前的研究已经确定了CTX诱导卵巢损伤的多种机制，包括但不限于卵泡闭锁、原始卵泡异常激活、卵巢间质纤维化和微血管损伤[4]。然而，CTX诱导卵巢功能障碍的精确病理生理机制尚未完全阐明。

铁死亡是一种依赖铁的调控性细胞死亡形式，其特征是铁的积累和致命的脂质过氧化[5]。这一过程已被确认为化疗诱导卵巢毒性的关键机制[6][7]。铁稳态是一种与铁死亡密切相关的代谢过程，对维持卵巢结构和功能至关重要。由于铁稳态失衡导致Fe²⁺过度积累，会催化Fenton反应，从而引发铁死亡[5]。虽然先前的研究表明环磷酰胺通过血红素加氧酶-1（HO-1）和活性氧（ROS）介导的线粒体功能障碍机制诱导卵巢铁死亡[6][8]，但铁稳态失调在这一过程中的具体作用仍不清楚。

线粒体在调节细胞内的铁死亡中起着关键作用。在生理条件下，细胞质中铁过载会导致线粒体铁蛋白隔离多余的游离铁，从而维持细胞铁稳态[9]。然而，研究表明，铁稳态失衡会导致线粒体中铁积累，引发氧化还原失衡并启动线粒体自噬[10]。新的证据表明，PM2.5引起的铁稳态失衡会通过线粒体自噬触发铁死亡，从而导致心脏肥大[11]。然而，化疗诱导的卵巢铁死亡中铁稳态与线粒体自噬之间的调控关系尚未明确。

本研究旨在探讨CTX与卵巢损伤之间的关联及其潜在机制。首先，我们使用小鼠模型研究了环磷酰胺（CTX）诱导的卵巢功能障碍和铁死亡现象。在体外实验中，我们利用KGN细胞进一步阐明了CTX诱导铁死亡的调控机制。通过使用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）、铁螯合剂去铁胺（DFO）和线粒体自噬抑制剂环孢素A（CSA），我们研究了铁稳态失衡与CTX诱导卵巢铁死亡中的线粒体自噬之间的功能相互作用和精确机制。我们的发现不仅为CTX的药理机制提供了新的见解，还为接受化疗的女性患者提供了保护生育能力的潜在治疗策略。

动物与实验处理

实验所用小鼠为4周大的ICR雌性小鼠（体重25-28克），来自宁夏医科大学实验动物中心（许可证编号：SCXK(Ningxia) 2020-0001）。小鼠在无特定病原体的条件下饲养（温度21-24°C，光照/黑暗周期12小时），并可自由获取水和维持饲料。所有动物实验均遵循国家研究委员会关于实验动物护理和使用的指南，并获得了批准。

CTX导致卵巢毒性并影响颗粒细胞功能

为了研究环磷酰胺（CTX）对卵巢功能的影响，我们建立了CTX诱导的卵巢损伤小鼠模型（图1A）。结果显示，CTX处理显著降低了卵巢器官指数（p<0.01）（图1C），但未影响卵巢重量（图1B）。此外，CTX处理导致血清雌二醇（E2）水平下降（p<0.01）和促卵泡激素（FSH）水平升高（p<0.01）（图1D-E），表明卵巢内分泌功能受损。

讨论

环磷酰胺（CTX）被广泛用于治疗多种恶性肿瘤，但其具有显著的生殖毒性，尤其是对年轻患者而言，会导致严重的卵巢功能损伤[19]。在本研究中，我们证实CTX会破坏卵巢细胞功能，改变激素谱，并降低卵巢的反应性。此外，我们还观察到CTX会引发原始卵泡的过早激活，并减少各发育阶段的卵泡数量。

结论

总之，本研究表明CTX通过引发颗粒细胞（GCs）中的铁死亡来破坏卵巢功能并干扰卵泡发育，这一过程是通过铁稳态失衡实现的。研究阐明了CTX如何促进线粒体内Fe²⁺的积累，并通过线粒体自噬增强GCs对铁死亡的敏感性。研究强调了纠正铁稳态失衡和增强GCs中的线粒体自噬作为治疗策略的潜力。

作者贡献声明

尚一彤：撰写、审稿与编辑。 韩航：概念构思。 傅旭峰：项目管理、资金获取、概念构思。 徐波：撰写初稿、方法学设计、数据整理、概念构思。 罗晓强：数据验证、监督、数据分析。 何腾蛟：数据验证、监督、软件使用。

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

数据获取

本研究的所有数据可应要求向通讯作者索取。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号：82560300）和宁夏自然科学基金（编号：2024AAC05067）的支持。