《Clinica Chimica Acta》：Profiling plasma transthyretin in healthy subjects and patients with cardiac ATTR amyloidosis by native electrophoresis
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血浆TTR结构异质性及临床检测方法研究。本研究通过优化原生聚丙烯酰胺凝胶电泳结合质谱技术，系统分析71例ATTR-CM患者和71名对照组血浆TTR结构。发现存在低（37-50 kDa）、中（50-100 kDa）和高分子量（>150 kDa）三种TTR组分，其中高MW组分与RBP4共迁移。证实常规血TTR定量检测不受影响，但该方法为理解TTR异质性及未来生物标志物研究提供新工具。
Maria Franzini|Chiara Sanguinetti|Veronica Musetti|Francesco Greco|Lidia Ciccone|Susanna Nencetti|Silvia Masotti|Vanessa Susini|Vincenzo Castiglione|Alberto Aimo|Liam A. McDonnell|Giuseppe Vergaro|Michele Emdin
意大利比萨大学转化研究部门及新型外科和医疗技术研究部门
摘要
背景
血浆转甲状腺素蛋白（TTR）在临床实验室中常规进行定量分析，但循环中TTR的结构异质性及其对实验室测量的潜在影响仍知之甚少。在转甲状腺素蛋白淀粉样变性心肌病（ATTR-CM）中，关于天然循环TTR形式的信息也非常有限。
方法
我们开发了一种经过分析优化的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术，随后通过Western blotting方法对人类血浆中的TTR和视黄醇结合蛋白4（RBP4）进行表征。分析了71名ATTR-CM患者和71名年龄及性别匹配的对照组样本。通过数据独立的质量谱分析对电泳条带进行了鉴定，并通过常规散射比浊法测定了总TTR含量。
结果
在两组样本中均检测到了三种循环TTR形式：低分子量形式（MW，37–50 kDa）、中等分子量形式（50-100 kDa）和高分子量聚集形式（>150 kDa）。仅有少数样本中检测到游离的天然TTR四聚体，而未观察到单体TTR。质谱分析证实了所有形式TTR的存在，并验证了TTR与RBP4在100 kDa条带中的共迁移现象。散射比浊法测定的TTR含量未受到体外降低pH值诱导的TTR聚集的影响，而天然PAGE技术在酸性条件下显示出的聚集模式与血浆中的不同。
结论
结合蛋白质组学验证的天然PAGE技术能够对临床血浆样本中的循环TTR形式进行解析表征。这种方法揭示了血浆TTR之前未被充分认识的结构异质性，证明了常规散射比浊法用于总TTR定量测定的可靠性，并为ATTR淀粉样变性的实验室研究提供了补充工具。
引言
转甲状腺素蛋白淀粉样变性（ATTR）是由于TTR淀粉样纤维在心脏、周围神经及其他组织和器官中的积累所致。TTR是一种同源四聚体蛋白，分子量为55 kDa，具有由非共价键稳定的四级结构，等电点为4.7–5.3 [1]。TTR主要由肝脏分泌，负责转运甲状腺素，并与视黄醇结合蛋白（RBP4）结合。TTR基因的常染色体点突变可能导致不稳定的四聚体合成，这些四聚体容易解聚为单体，进而形成淀粉样纤维 [2]。
由基因突变引起的ATTR变异型（ATTRv）淀粉样变性可表现为心肌病（CM）、神经病变或混合表型 [3]。即使是野生型（wt）TTR，在年龄相关的蛋白质稳态机制变化下也可能具有致淀粉样性 [3]。ATTRwt主要表现为限制性心肌病 [3]，并且越来越多地被认为是心力衰竭、心房心律失常和传导系统疾病的重要原因，尤其是在老年人中 [4]、[5]、[6]。
T4或其他分子在T4结合位点的结合可以稳定四聚体状态，有效抑制TTR聚集，表明四聚体的稳定性可以防止其解离 [7]、[8]。RBP4和视黄醇-RBP4复合物通过与TTR结合来稳定四聚体，从而防止其解体和淀粉样纤维的形成 [9]、[10]。已有用于临床的TTR四聚体稳定药物。有证据表明TTR稳定剂可以增加循环中的TTR水平 [11]、[12]，但通过连续测量TTR水平来追踪治疗效果的可能性仍有待研究。循环中的TTR本身无法帮助诊断ATTR，而测量淀粉样级联反应中的特定中间产物可能具有诊断价值。已开发出针对ATTRv患者血浆中存在的非天然寡聚体TTR形式的诊断探针 [13]。随后，作者设计了一种新型免疫测定方法，使用特异性抗体来检测这些形式 [14]。最近，Pedretti等人开发了一种TTR聚集物检测探针，能够结合患者组织和血液中的TTR纤维和聚集物 [15]。
所有这些方法都针对特定的聚集中间产物，因此可能具有诊断价值，但它们无法提供关于循环中TTR形式的全面信息。大多数证据来自在变性条件下（如低pH值）进行的体外研究 [6]、[16]、[17]，这些条件会导致TTR四聚体解聚为二聚体和单体，这被认为限制了TTR重新聚集为淀粉样纤维的过程 [18]。
然而，在ATTR淀粉样变性患者的血液中识别非天然寡聚体TTR仍然具有挑战性，同时，对于循环中不同TTR形式（例如聚集形式与非聚集形式）也缺乏清晰或系统的描述。此外，循环中可能存在非天然TTR形式，这也引发了关于临床实验室常用散射比浊法测量TTR效果的质疑。
在这项研究中，我们应用了天然电泳技术系统地分析了健康受试者和ATTR-CM患者体内的循环TTR形式。
患者群体
从ATTR-CM患者和年龄及性别匹配的无ATTR-CM淀粉样变性对照组受试者中收集了外周血样本。连续入组的ATTR-CM患者来自意大利比萨的Fondazione Toscana Gabriele Monasterio专科门诊。根据现行指南 [19] 诊断出ATTR-CM。这些患者至少已接受一个月的稳定治疗，且尚未使用任何TTR稳定剂。对照组受试者为
研究人群
共纳入了71名ATTR-CM患者和71名性别及年龄匹配的无ATTR-CM对照组受试者。ATTR-CM患者和对照组受试者的TTR及RBP4水平相似，但ATTR-CM患者的NT-proBNP、hs-cTnT和估算的肾小球滤过率水平较高（见表1）。在71名ATTR-CM患者中，有3人携带致病性突变（p.Ile88Leu，n=2；p.Phe84Leu，n=1）。在患者和对照组中均未观察到统计学上的显著相关性
讨论
在这项研究中，我们开发并优化了一种使用天然PAGE技术结合Western blotting分析血浆TTR的方案。讨论了技术细节，包括缓冲液和凝胶组成、电泳条件以及印迹参数，以确保结果的可重复性和清晰度。将该方法应用于ATTR-CM患者及其匹配的对照组后，我们首次检测到了多种TTR形式并对其进行了表征。
结论
目前，不同循环TTR形式的临床意义尚待确定。本研究并未展示出诊断或预后价值，而是为在天然条件下表征循环TTR形式提供了分析框架。更深入理解TTR的结构异质性可能有助于未来研究，以评估特定TTR形式在特定临床环境中的生物标志物潜力。
资金来源
本研究得到了Fondazione Pisa（意大利比萨；协议编号313/22；项目名称：比萨地区的转甲状腺素蛋白心脏淀粉样变性：识别以进行治疗）和意大利大学与研究部（PRIN：2022KJB3B7；CUP：I53D23004260006；项目名称：全面理解转甲状腺素蛋白淀粉样聚集体引起的心肌细胞功能障碍的分子机制）的研究资助。
写作过程中人工智能辅助技术的声明
在准备本稿时，作者使用了ChatGPT 5.2来提高手稿的可读性和语言表达。使用该工具后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对发表文章的内容负全责。
CRediT作者贡献声明
Maria Franzini：撰写——初稿、形式分析、概念构思。Chiara Sanguinetti：撰写——审稿与编辑、方法学、研究、数据管理。Veronica Musetti：撰写——审稿与编辑、方法学、研究、数据管理。Francesco Greco：撰写——审稿与编辑、研究、数据管理。Lidia Ciccone：撰写——审稿与编辑、研究。Susanna Nencetti：撰写——审稿与编辑、监督、资金争取。Silvia Masotti：撰写——伦理批准
该实验方案已获得当地伦理委员会的批准（TACTIC研究，编号23,481；CATCH，编号18,456）。所有实验均遵循赫尔辛基宣言进行，所有患者均签署了书面知情同意书。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。
