ZFP36和CEBPA是与巨噬细胞相关的预后生物标志物，它们与ANCA相关性肾小球肾炎中的肾小球内皮炎症有关

《Experimental Cell Research》：ZFP36 and CEBPA are macrophage-associated prognostic biomarkers linked to glomerular endothelial inflammation in ANCA-associated glomerulonephritis

ANCA相关肾小球肾炎（AAGN）中巨噬细胞浸润与ZFP36、CEBPA基因表达及肾小球内皮损伤的关系研究。通过免疫组化分析发现AAGN肾组织巨噬细胞激活与预后不良相关，GEO数据库验证ZFP36下调和CEBPA上调与疾病进展正相关，并证实二者在肾小球内皮细胞中表达，通过调控NF-κB信号通路影响炎症因子TNF-α和IL-6的分泌。

　　

倪安琪|朱新奇|王俊妮|陈亮亮|朱环环|苗金|徐建航|任平平|陈江华|肖亮|韩飞

浙江大学医学院附属第一医院肾脏病中心，浙江大学肾脏病学研究所，浙江省肾脏与泌尿系统疾病临床研究中心，中国杭州

摘要

背景

巨噬细胞在抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）相关性肾小球肾炎（AAGN）的发病机制中起着关键作用。本研究探讨了AAGN肾组织中与巨噬细胞相关的基因（MAGs）ZFP36和CEBPA，并评估了它们在肾小球内皮损伤中的作用。

方法

通过免疫组织化学方法评估了肾组织中的巨噬细胞浸润及其与预后的关系。利用基因表达组学数据库（GEO）鉴定ZFP36和CEBPA的表达情况，并分析了它们在AAGN中的表达情况及其与免疫细胞浸润和临床指标的关联。使用健康个体和AAGN患者的血清刺激人肾小球内皮细胞（HRGECs），并通过Western blotting和实时PCR检测ZFP36和CEBPA的表达。功能研究包括基因敲低和过表达、放线菌素D处理实验、NF-κB抑制实验以及与THP-1来源的巨噬细胞的共培养实验。

结果

AAGN肾组织中存在显著的免疫细胞浸润和巨噬细胞活化现象，预示着较差的预后。ZFP36表达下调且与较差的预后相关，而CEBPA表达上调且也与较差的预后相关。免疫荧光显示这两种蛋白部分定位于CD31阳性的肾小球内皮区域。在HRGECs中，ZFP36可减弱炎症反应，加速TNF-α和IL-6 mRNA的降解，并抑制NF-κB的活化；而CEBPA则促进内皮炎症介质的表达。在共培养实验中，内皮细胞中的ZFP36表达降低，而CEBPA表达升高，导致相邻巨噬细胞中的TNF-α产生增加。

结论

ZFP36和CEBPA是与AAGN中的免疫细胞浸润、肾预后及内皮炎症反应相关的巨噬细胞相关基因，可能作为潜在的组织生物标志物和治疗靶点。

引言

抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）相关性血管炎（AAV）的特征是小到中等大小血管的炎症，以及存在针对中性粒细胞和单核细胞胞浆蛋白酶的自身抗体，其中最常见的自身抗体针对髓过氧化物酶（MPO）和蛋白酶3（PR3）。¹肾脏受累，也称为ANCA相关性肾小球肾炎（AAGN），是AAV最常见的表现形式之一，超过一半的患者会出现这种情况²，并可能导致终末期肾病（ESRD）或死亡³。因此，深入理解AAGN的发生和发展机制对于疾病的早期诊断和治疗以及寻找新的治疗靶点至关重要。

ANCA诱导的中性粒细胞和单核细胞活化会触发替代补体途径的激活，从而在血管壁上引发炎症放大循环，吸引并活化中性粒细胞，导致呼吸爆发、脱颗粒、细胞凋亡和坏死⁴。研究表明，单核细胞/巨噬细胞在AAGN的发病和进展中起着重要作用⁵。血液中的单核细胞是组织巨噬细胞的前体。进入组织后，单核细胞分化为巨噬细胞，共同构成单核吞噬细胞系统。巨噬细胞影响肾病的进展和纤维化^{6, 7}，减少巨噬细胞或抑制巨噬细胞浸润可以减轻肾损伤和纤维化^{8, 9}。AAGN患者的肾组织学显示巨噬细胞显著浸润^{10, 11}，这些巨噬细胞不仅存在于早期病变部位（如纤维素样坏死和细胞新月体），也存在于看似正常的肾小球中，且数量比其他细胞类型（如中性粒细胞）更多¹²。凋亡中性粒细胞表面胞浆蛋白酶的表达会损害巨噬细胞的吞噬功能，导致炎症细胞因子和免疫原性成分的释放，可能进一步活化中性粒细胞、T细胞和B细胞，并产生ANCA，从而形成恶性循环⁵。此外，在炎症性肾组织中可检测到巨噬细胞的增殖标志物，表明除了炎症招募外，细胞增殖也是局部巨噬细胞浸润的原因之一¹³。巨噬细胞在炎症部位的增殖可能是加剧损伤的重要机制。鉴于巨噬细胞在AAGN的免疫激活和相关病理变化中的关键作用，探索与巨噬细胞相关的基因（MAGs）的生物学和临床意义也有助于推进AAGN的分子诊断和免疫调节疗法的发展。

在本研究中，我们对AAGN患者的肾脏中的MAGs进行了系统的研究。这里的MAGs指的是通过肾转录组分析鉴定出的、其表达与巨噬细胞浸润/活化特征显著相关的基因，而不仅仅是巨噬细胞特异性表达的基因。首先，我们使用临床标本验证了AAGN肾组织中巨噬细胞的丰富浸润，并探讨了其与肾预后的相关性。随后，我们利用基因表达组学数据库（GEO）鉴定关键MAGs，并采用单样本基因集富集分析（ssGSEA）来分析关键MAGs与免疫浸润的相关性。然后，我们在临床样本中确认了这些关键MAGs的显著差异表达，并进一步分析了它们与免疫细胞、临床指标和肾预后的关系。鉴于肾小球内皮损伤是AAGN的关键病理事件，我们使用患者血清刺激的HRGECs来研究这些候选基因是否在疾病相关条件下参与内皮炎症反应。最后，为了进一步探讨它们的功能作用，我们在体外沉默或过表达了这些关键MAGs。我们的发现为AAGN的炎症微环境提供了新的见解，并为该疾病提供了潜在的治疗靶点。

数据收集处理

我们从GEO数据库中获得了两个与AAGN相关的微阵列数据集（GSE104948和GSE108109）¹⁴。GSE104948数据集包含22个AAGN样本和18个对照样本，作为训练数据集；GSE108109数据集包含15个AAGN样本和6个对照样本，作为测试数据集。此外，还使用了GSE99339数据集来研究这些关键MAGs在其他类型的免疫复合性肾小球肾炎（包括狼疮性肾炎（LN）、IgA

AAGN中的巨噬细胞浸润增加且与较差的肾预后相关

为了确定AAGN患者中巨噬细胞浸润是否增加，我们分析了GEO数据库（GSE104948）中的免疫细胞浸润情况。与正常组织相比，我们发现大多数类型的免疫细胞浸润均增加，其中巨噬细胞浸润水平升高（图1a）。此外，我们还观察到许多细胞因子的水平也升高，如IL1β、IL6、IL7、IL15、IL16、IL32、TNF、CXCL8、CCL2、CCL4和CCL18（补充图S1a–k）。然而，仅

讨论

AAV仍然是最具破坏性和潜在致命性的自身免疫性炎症性疾病之一。尽管针对AAV的治疗策略已从传统的细胞毒性药物发展为更精准的疗法（如利妥昔单抗），但AAGN患者的肾预后仍然不理想²⁰。巨噬细胞在AAGN的发病和发展中起着关键作用，参与免疫激活、坏死性炎症和纤维化等过程

CRediT作者贡献声明

韩飞：写作 – 审稿与编辑、可视化、验证、监督、资源管理、项目管理、方法学、数据分析、概念构建。倪安琪：写作 – 审稿与编辑、初稿撰写、软件使用、方法学、研究设计、数据分析、概念构建。陈江华：项目管理、概念构建。肖亮：监督、项目管理、概念构建。陈亮亮：研究设计、数据管理。朱环环：

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数据和材料的可用性

本研究分析的数据集可向通讯作者韩飞索取。

伦理批准和参与同意

本研究遵循赫尔辛基宣言，并获得了浙江大学医学院附属第一医院伦理委员会的批准（批准编号2020617）。所有参与者均提供了书面知情同意书，且本研究未涉及未成年人。

出版同意

不适用。

资助

本研究得到了国家自然科学基金对王俊妮（82100792）、任平平（82100738）和韩飞（82270706）的资助，以及浙江省重点研发计划（2020C03034）对韩飞的资助。

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突或可能影响本文研究的个人关系。

致谢

不适用。