Miichthys miiuy鱼类的C型溶菌酶对革兰氏阴性细菌具有特定的抗菌活性

《Fish & Shellfish Immunology》：The C-type Lysozyme of Miichthys miiuy Exhibits Specific Antibacterial Activity against Gram-negative Bacteria

本研究从米氏鲈中克隆并功能表征了新型c型溶菌酶mmi-LyzC，证实其对革兰氏阴性菌具有强效抗菌活性，优化了原核表达条件，为水产病害绿色防控提供新靶点。

　　

潘子月|赵燕|单思琪|徐天军|孙玉娜

中国上海海洋大学渔业与生命科学学院鱼类分子免疫学实验室

摘要

溶菌酶是鱼类先天免疫系统中的关键抗菌分子，在抵御病原体入侵中起着核心作用。本研究从Miichthys miiuy中鉴定并功能表征了一种新型C型溶菌酶（mmi-LyzC）。其全长cDNA为432 bp，编码一种包含保守LYZ_C结构域的143个氨基酸的蛋白质，其中活性位点Glu⁵⁰和Asp⁶⁷在各种硬骨鱼类中高度保守。在LPS刺激后，免疫相关组织中mmi-LyzC的表达显著上调，48小时时达到峰值。重组mmi-LyzC蛋白（rMmiLyzC）对两种革兰氏阴性菌表现出强烈的抗菌活性，而对一种革兰氏阳性菌仅表现出中等活性。该蛋白在30°C下用0.1 mM IPTG诱导12小时后产量最高，并且在pH 5–8范围内保持稳定。本研究揭示了mmi-LyzC对两种革兰氏阴性菌的强大抗菌活性，为提高水产养殖中的细菌抗性提供了潜在靶点。

引言

近年来，鱼类养殖密度的增加导致了细菌疾病的频繁爆发、高死亡率以及该行业发展的严重限制[1]。目前，通过外部投入的方法（如抗生素、化学物质和其他补充剂）可以暂时缓解疾病造成的损失，但这些方法存在许多显著局限性[2]。例如，在某些水产养殖领域滥用抗生素会加剧抗菌素耐药性问题，并影响对细菌性传染病的控制能力[3]。研究表明，大量用于水产养殖的抗生素可能进入周围环境（通过排泄物和未食用的药物饲料），这些残留抗生素会在环境中长期存在并持续破坏水生微生物群落的稳定性[5]。因此，为了进一步提高水产养殖的可持续性，筛选和鉴定可通过饲料或水途径施用的抗生素替代品已成为当前产业发展中亟待解决的关键问题[2]。

溶菌酶是先天免疫系统中的关键分子之一[6]。作为一种能够水解细菌细胞壁肽聚糖的糖苷水解酶，它通过破坏N-乙酰葡糖胺（NAG）和N-乙酰胞壁酸（NAM）之间的β-(1,4)-糖苷键来破坏细菌的结构完整性，最终因渗透压作用导致细菌裂解[7]。在水产养殖领域，鱼类的适应性免疫系统相对原始，先天免疫分子的功能特性直接决定了它们的抗病能力。作为鱼类体液免疫中的关键效应分子，C型溶菌酶（LyzC）不仅在抵御病原菌入侵中起核心作用，还为绿色防控水产养殖疾病提供了重要的分子靶点和应用潜力，具有广泛的发展价值。

先前的研究表明，鱼类溶菌酶具有组织特异性表达模式，在病原体刺激后其表达水平显著上调。例如，Takifugu obscurus中的LyzC在肝脏中高度表达，其表达水平在Vibrio刺激后24小时达到峰值[8]；Carassius auratus中的LyzC也在肝脏中高度表达，重组鲫鱼溶菌酶对Aeromonas salmonicida表现出显著的抗菌活性[9]。Hikima等人将Marsupenaeus japonicus的溶菌酶表达在昆虫细胞中，并证实其对多种Vibrio物种和鱼类病原菌具有杀菌活性[10]。Hikima等人的研究表明，在健康的Paralichthys olivaceus中，LyzC在头部肾脏、后部肾脏、脾脏、大脑和卵巢等组织中显著转录；在Edwardsiella

对水生动物C型溶菌酶的众多体外

M. miiuy中溶菌酶C的鉴定

为了定位M. miiuy中的溶菌酶C，本研究参考了从NCBI数据库中获取的Larimichthys crocea的溶菌酶序列（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）。通过与本地BLASTn和tBLASTn程序的比较分析，成功从M. miiuy数据库中筛选获得了溶菌酶的mRNA和DNA序列，为后续相关研究奠定了基础[13]。

生物信息学分析

使用Expasy网站（//web.expasy.org/protparam/）对溶菌酶C的开放阅读框进行了翻译。

溶菌酶C的进化与结构分析

本研究首先分析了mmi-LyzC的特性。该基因源自M. miiuy的第18号染色体，编码序列（CDS）为432 bp，编码143个氨基酸。该蛋白的分子量约为16.1 kDa，理论等电点（pI）为8.7。mmi-LyzC包含13个磷酸化位点（9个Ser、3个Thr、1个Tyr），以及高度保守的活性位点Glu⁵⁰、Asp⁶⁷和8个半胱氨酸残基，这些残基构成了催化中心并维持了蛋白质的结构稳定性

讨论

从遗传结构和进化角度来看，M. miiuy中的溶菌酶C高度反映了溶菌酶家族的保守性。其基因组具有4个外显子和3个内含子的结构特征，与其他11个物种高度一致，证实了该基因在长期进化过程中的基因组组织稳定性，以及其在物种生存和免疫防御中的核心功能作用。M. miiuy溶菌酶包含一个保守的LYZ_C结构域和活性位点

作者贡献

潘子月、单思琪：撰写初稿、验证、正式分析、数据整理。赵燕：方法学设计、审稿与编辑。徐天军：指导、概念构建、正式分析。孙玉娜：指导、概念构建、正式分析、审稿与编辑。