《Genomics》：Targeted epigenome sequencing of eosinophils reveals CpG sites and regulatory variants associated with asthma
编辑推荐：
嗜酸性粒细胞是哮喘炎症的核心参与者，但其甲基化谱在哮喘中的作用尚不清楚。本研究利用定制的测序panel对183例纯化的嗜酸性粒细胞样本进行了表观基因组范围关联研究（EWAS），鉴定出与哮喘显著相关的CpG位点和调控性变异，并通过整合多组学数据揭示了其在嗜酸性粒细胞驱动的哮喘发病机制中的潜在作用，为理解哮喘的表观遗传结构提供了新见解。
想象一下，当你呼吸时，数以千万计的微小细胞在你的肺部协同工作，维持着呼吸道的健康与平衡。然而，对于全球数亿哮喘患者而言，这个过程可能充满了挑战。哮喘是一种复杂的慢性呼吸道疾病，其发病涉及遗传与环境因素的复杂互作。近年来，表观遗传机制，特别是DNA甲基化，被认为是连接遗传易感性和环境暴露的关键桥梁。在参与哮喘的多种免疫细胞中，嗜酸性粒细胞（eosinophils）扮演着“核心攻击手”的角色。在哮喘患者的外周血和支气管肺泡灌洗液中，它们数量异常增多，一旦被激活，便会释放大量细胞毒颗粒蛋白和促炎细胞因子，对肺细胞造成损伤，加剧气道炎症和疾病严重程度。尽管其作用至关重要，但此前关于哮喘中嗜酸性粒细胞DNA甲基化变化的研究却寥寥无几，且大多依赖于覆盖范围有限的微阵列技术，这限制了对哮喘表观遗传机制的深入探索。
为了填补这一空白，一项发表于《Genomics》期刊的研究，对来自加拿大萨格奈-圣约翰湖（SLSJ）哮喘家系队列的183例纯化嗜酸性粒细胞样本，进行了一项创新的靶向表观基因组测序分析。该研究旨在系统描绘哮喘患者嗜酸性粒细胞的甲基化谱，并阐明其背后的潜在遗传调控机制。研究使用了一个定制的靶向测序panel，专注于免疫细胞的调控区域，覆盖了4,609,564个CpG位点，其覆盖深度和广度远超传统方法。
通过这项研究，科学家们取得了突破性的发现。他们鉴定出两个与哮喘达到全基因组显著关联的CpG位点，以及五个呈现提示性关联的位点。这些位点中的两个——位于SLC9A2和MAEA基因内部的位点——表现出了在哮喘患者与健康对照之间最显著的甲基化水平差异。更重要的是，通过整合来自同一样本的基因型数据和转录组数据，研究揭示了这些甲基化差异背后的遗传调控网络。特别是，研究发现了甲基化水平、特定遗传变异与关键基因表达之间的复杂关联网络，涉及EFNA5、GNAQ、LIMK1等基因，而这些基因在哮喘相关的信号通路（如EphrinA-Eph受体信号通路、G蛋白信号通路）中扮演着重要角色。这些发现不仅揭示了哮喘中先前未被发现的表观遗传标记，还首次系统地阐释了嗜酸性粒细胞内DNA甲基化、遗传变异和基因表达三者之间的调控关系，强调了从特定细胞类型出发进行靶向表观遗传分析的重要性。这为理解哮喘的“缺失遗传力”提供了新视角，并可能为未来开发针对嗜酸性粒细胞表观遗传状态的精准治疗策略提供潜在的分子靶点。
为了开展这项研究，研究人员运用了多项关键技术方法。首先，他们从萨格奈-圣约翰湖（SLSJ）哮喘家系队列参与者的血液中，通过密度梯度和负向磁珠分选技术分离出高纯度的嗜酸性粒细胞。其次，利用定制的、靶向免疫细胞调控区域的甲基化捕获测序panel，对纯化细胞样本的DNA进行深度测序，以获取高分辨率的全基因组DNA甲基化数据。同时，对同一样本进行RNA测序以获取基因表达数据，并利用基因芯片结合基因型填充技术获取了高密度的遗传变异数据。在数据分析层面，核心方法包括：表观基因组范围关联研究（EWAS）以鉴定哮喘相关的CpG位点；甲基化数量性状位点（mQTL）分析和表达数量性状位点（eQTL）分析，分别探究遗传变异对甲基化水平和基因表达的影响；以及相关性分析，用于评估甲基化水平与邻近基因表达之间的关系。
2.1. Association between DNA methylation levels and asthma
研究人员首先进行了表观基因组范围关联研究（EWAS）。结果表明，在调整了年龄、性别、吸烟状态等混杂因素后，有两个CpG位点与哮喘的关联达到了全基因组显著性水平（P < 5E-08）。其中一个位点（Chr2:103,279,574）位于SLC9A2基因体内，在哮喘个体中甲基化水平低于对照组。另一个位点（Chr4:1,320,665）位于MAEA基因体内，在哮喘个体中甲基化水平更高。此外，还有五个CpG位点显示出提示性关联（P < 1E-06）。这些位点或其邻近基因中，有六个（如CNTN5, GRIK3, MAEA, SLC9A2, ZC3H12A, ZCWPW1）与免疫应答功能相关。这表明，哮喘相关的DNA甲基化变化富集在与免疫调控相关的基因组区域。
2.2. Association between methylation levels and genetic variants
为了探索上述甲基化差异是否受遗传因素调控，研究人员进行了甲基化数量性状位点（mQTL）分析。分析发现，cis-mQTL（顺式作用，距离<1Mb）和trans-mQTL（反式作用，距离≥1Mb）分析均鉴定出大量与这些哮喘相关CpG位点显著关联的遗传变异。特别是，在trans-mQTL分析中发现的遗传变异，其邻近基因中有75个与免疫和/或呼吸功能相关。其中，有六个已知的遗传变异此前已被全基因组关联研究（GWAS）或文献报道与哮喘、肺功能或免疫应答相关。这证实了遗传背景对嗜酸性粒细胞甲基化状态具有广泛的调控作用，部分调控可能通过长距离的基因间相互作用实现。
2.3. Association between methylation levels, expression levels, and genetic variants
最后，研究通过整合分析，揭示了甲基化、遗传变异和基因表达三者之间最具有生物学意义的调控网络。三个关键的CpG位点（Chr2:103,279,574, Chr1:6,267,177, Chr7:100,027,356）被重点分析。结果发现：
- 1.
位于SLC9A2基因内的显著CpG位点（Chr2:103,279,574），通过cis-mQTL与115个靠近TMEM182基因的遗传变异相关，而其中56个变异又通过trans-eQTL与位于另一条染色体上的EFNA5基因的表达相关。
- 2.
一个提示性CpG位点（Chr1:6,267,177）通过trans-mQTL与靠近LIMK1和ELN基因的三个遗传变异相关，其中两个变异（rs1091812, rs2855726）通过cis-eQTL影响LIMK1基因的表达，而所有三个变异都通过trans-eQTL影响GNAQ基因的表达。
- 3.
另一个提示性CpG位点（Chr7:100,027,356）通过trans-mQTL与四个靠近PTPRC基因的变异相关，这四个变异此前均被报道与哮喘、免疫或肺功能相关。
研究结论与重要意义
本研究通过靶向嗜酸性粒细胞的表观基因组测序，成功绘制了与哮喘相关的DNA甲基化谱。研究不仅鉴定出两个全新的、达到全基因组显著水平的哮喘相关CpG位点（位于SLC9A2和MAEA基因），还揭示了五个具有提示性关联的位点。这些表观遗传标记此前从未被报道与哮喘或相关表型相关，凸显了针对特定细胞类型进行深度测序的价值。
更重要的是，通过多组学数据整合，研究构建了一个从遗传变异到DNA甲基化，再到基因表达的复杂调控网络。研究发现，部分哮喘相关的甲基化变化受到遗传变异的调控（表现为mQTL），而这些遗传变异同时也能影响关键哮喘相关基因（如EFNA5, GNAQ, LIMK1）的表达（表现为eQTL）。尽管在甲基化水平与最邻近基因表达之间未发现直接的强相关性，但这种共有的上游遗传调控模式强烈提示，所发现的CpG位点可能通过间接的、由遗传驱动的复杂网络来调控嗜酸性粒细胞的功能。
这项研究的核心意义在于，它将哮喘的遗传风险、表观遗传调控和特定免疫细胞（嗜酸性粒细胞）的生物学功能紧密联系了起来。研究所强调的五个关键基因——EFNA5、GNAQ、LIMK1、MAEA和SLC9A2——均已知参与哮喘相关的病理过程，如气道炎症、重塑（airway remodeling）和免疫信号传导（如EphrinA-EphR信号通路、G蛋白信号通路）。因此，该研究不仅为哮喘的“缺失遗传力”提供了表观遗传层面的解释，也指明了未来研究的关键分子靶点和通路。它证明了，通过对疾病核心细胞类型进行靶向、深度的表观基因组分析，能够更有效地揭示传统全血或组织水平分析所无法捕捉到的、具有高度细胞特异性的疾病机制，从而为理解哮喘的个体化发病机理和开发新的治疗策略开辟了新途径。
