《Infection, Genetics and Evolution》：Single-cell RNA sequencing reveals the characteristics of porcine viral diseases, development, and immune repertoires: Current status and challenges
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这篇综述系统梳理了单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术在猪研究中的最新应用，聚焦于其在解析病毒致病机制（如非洲猪瘟病毒（ASFV）、猪流感病毒（PIV）和猪流行性腹泻病毒（PEDV））、揭示组织发育（如肠道、生殖细胞和骨骼肌）以及剖析免疫细胞异质性与受体库动态中的关键发现。文章不仅展示了scRNA-seq如何以前所未有的分辨率解码细胞异质性、发育轨迹和免疫应答，还讨论了该技术在猪基因组注释、样本处理与数据分析方面面临的独特挑战，为猪作为重要农业动物和人类疾病理想模型的转化研究提供了深刻见解。
单细胞RNA测序技术为猪的生物学研究带来了革命性的视角，尤其在揭示病毒性疾病机制、发育过程以及免疫系统复杂性方面展现出强大能力。
scRNA-seq在猪疾病监测中的应用
病毒感染会引发宿主机体复杂的细胞异质性反应。例如，在非洲猪瘟（ASF）研究中，scRNA-seq揭示了ASFV感染导致脾脏中巨噬细胞大量死亡，并发现巨噬细胞向不成熟CD14-单核细胞的转化可能与病毒持续性感染有关。在猪肺泡巨噬细胞感染模型中，病毒基因如MGF_110、MGF_360和MGF_530/505的动态表达抑制了宿主细胞的I型干扰素产生和抗病毒反应。此外，TNF-α的上调与感染后巨噬细胞凋亡相关，为疫苗研发提供了新靶点。
对于猪流感病毒，研究发现在接种IL-1β疫苗后，功能性调节性T（Treg）细胞数量的减少导致了细胞因子失衡和炎症损伤。猪流行性腹泻病毒（PEDV）的研究则发现，其与SARS-CoV-2类似，通过识别血管紧张素转换酶2（ACE2）感染肠道上皮细胞，而细胞内再生胰岛衍生蛋白3γ（REG3G）可通过激活IL33-STAT3信号通路抑制病毒复制。
scRNA-seq在猪发育监测中的应用
该技术在解析猪组织器官发育的细胞异质性、谱系分化和分子调控机制方面具有独特优势。
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黏膜发育与免疫：对猪盲肠细胞从出生到断奶关键发育阶段的动态图谱分析显示，随着发育阶段推进，CD8+T细胞和低表达自然杀伤（NK）细胞的比例增加，而上皮细胞和Treg细胞的比例下降。断奶后，上皮细胞中线粒体基因如环氧合酶1（COX1）和环氧合酶2（COX2）上调，通过调节前列腺素产生影响炎症反应。猪肠道固有层中的先天淋巴样细胞（ILC）以ILC3s亚型为主，其基因表达谱和空间分布与人类高度相似，提示猪是研究人类肠道免疫疾病的理想模型。
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生殖细胞与胚胎发育：对沙梓岭猪睾丸组织的研究首次明确了精原干细胞（SSC）在发育过程中具有阶段特异性的转录谱，NOTCH、WNT和TGF-β等信号通路在调节SSC自我更新和分化中起核心作用。研究发现，体内自然发育的胚胎、体外受精（IVF）胚胎和孤雌激活（PA）胚胎在染色质重塑和能量代谢通路上存在显著差异，这可能是后者发育效率较低的关键因素。
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骨骼肌发育：比较藏猪（ZZ）和杜藏杂交猪（DZ）胚胎期体节和生肌节中的肌细胞发现，远端调控区介导的染色体相互作用以及EGR1和RHOB基因与猪胚胎肌细胞分化相关。对肥胖型和瘦肉型猪骨骼肌细胞的比较研究表明，两者差异与肌肉发育、离子稳态、细胞凋亡和MAPK信号通路等多个过程相关，且瘦肉型猪的成肌谱系细胞中Ca2+浓度较低，具有更大的分化潜能。
揭示免疫细胞的异质性
scRNA-seq能够精确鉴定猪的各种免疫细胞类型，其组成、空间分布和功能状态与人类免疫细胞表现出惊人的相似性。
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常规T细胞：对猪外周血T细胞亚群的分析首次定义了初始CD8+T细胞、中间分化CD8+T细胞、终末分化CD8+T细胞和效应CD8+T细胞，并揭示了它们之间的潜在分化轨迹和显著异质性。不同转录因子（TF）在不同亚群中特异性高表达，如初始细胞高表达LEF1、TCF7。
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不变自然杀伤T（iNKT）细胞：猪iNKT细胞在未激活状态下主要表达CD8α，激活后能表达CD25、MHC II等标志物，并分泌干扰素-γ（IFNγ），表现出快速脱颗粒能力。scRNA-seq分析发现了两个不同的iNKT细胞亚群（iNKT-sw1和iNKT-sw2）。
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γδ T细胞：在猪外周血、上皮组织和炎症部位，γδ T细胞是淋巴细胞群中不可或缺的关键组成部分。研究发现CD2+CD8α+γδ T细胞表现出更强的细胞活化和效应功能。在回肠中鉴定出循环型、细胞毒型、非初始型等多种γδ T细胞亚型，并发现其空间分布与人类相似。
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黏膜相关恒定T（MAIT）细胞：猪的MAIT细胞能够识别病原菌产生的核黄素通路代谢物，其T细胞受体（TCR）α链的CDR3α序列（CAVRDSSYQLIW）在哺乳动物中高度保守。猪MAIT细胞表达多种细胞表面标志物，如IL-18Rα和趋化因子受体，使其能够迁移至黏膜相关组织。
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自然杀伤（NK）细胞与巨噬细胞：研究发现猪肝脏驻留CD8a-dim NK细胞具有抗炎特性。在ASFV感染中，scRNA-seq揭示了病毒导致脾脏巨噬细胞大量死亡，并将感染传播给不表达或弱表达CD14的单核细胞亚群，这些细胞可能借此逃避免疫监视。
探索免疫受体组库的特征
结合单细胞TCR/BCR测序（scTCR/BCR-seq），能够深入研究免疫细胞发育机制以及疾病和治疗后的克隆扩增动态。
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TCR组库：对感染流感病毒的猪肺组织细胞分析发现，大多数成熟T细胞共表达TCRα和TCRβ链。TCRβ链在Vβ和Jβ区域表现出特定的组合偏好。对猪γδ TCR多样性的研究发现，CD2+和CD2-γδ T细胞的主要克隆型不同，且CD2的表达可能与TCR-γ链多样性的增加有关。
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BCR组库：对感染流感病毒的猪肺细胞BCR分析表明，IGHG1亚类是IgG重链使用的主要基因型，并鉴定出高频使用的V(D)J基因。在猪B细胞发育过程中，免疫球蛋白轻链（IgL）基因的重排先于重链（IgH）基因发生，且几乎所有B细胞前体在IgH重排前都是IgLλ+。
挑战与未来展望
尽管scRNA-seq应用前景广阔，但仍面临挑战：猪基因组注释的完整性不及人类和小鼠；大型组织样本处理存在技术难点且成本高昂；现有生物信息学工具多基于人类或小鼠数据开发，直接应用于猪数据易产生偏差。
未来发展趋势包括：构建全面的“猪细胞图谱”作为参考；开发猪特异性生物信息学工具和分析流程；整合单细胞ATAC测序（scATAC-seq）、空间转录组学等多组学技术，以构建关键组织的多组学细胞图谱。通过持续的技术创新和机制探索，猪模型有望在人类健康与疾病治疗、异种移植等前沿领域发挥更关键的作用。
