《ACS Chemical Biology》：A Modular Platform for Quantitative Two-Color Bioluminescence Combining NanoLuc and Red-Shifted NanoPrism Luciferases
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为解决生物发光报告基因在多重检测中因发射光谱单一受限的问题，本文报道了一种新型的双色生物发光定量平台。研究者通过将环状置换的NanoLuc（NanoLuc luciferase）或其互补变体（LgBiT/SmBiT）插入自标记HaloTag蛋白，开发出高效的BRET（生物发光共振能量转移）报告分子NanoPrism荧光素酶。与未修饰的NanoLuc配对后，该系统可在一个样品中实现>100 nm光谱分离的双信号同时定量，成功应用于监测蛋白质降解与信号通路动态。此平台为细胞生物学研究提供了更精确、便捷的多重检测工具。
在探索生命奥秘的细胞实验室里，科学家们常常像侦探一样，试图同时追踪多个关键的生物分子事件。传统上，生物发光报告基因因其高灵敏度和低背景，成为监测细胞活动的得力工具。其中，NanoLuc荧光素酶及其变体（如LgBiT/SmBiT、LgBiT/HiBiT）尤为出色，它们亮度高、稳定性好，非常适合进行长时间的动力学测量。然而，一个令人头疼的局限性在于，基于NanoLuc的系统通常只发出单一波长的蓝光（峰值约460纳米），这就像在一个嘈杂的房间里，所有人都用同一种语言喊话，难以区分谁说了什么。这使得科学家们难以在同一份细胞样本中，同时、定量地监测两个不同的生物过程，例如同时观察一个药物靶点的降解和一个内参蛋白的稳定性。为了解决这个“一色难求”的瓶颈，研究人员亟需开发出能够发出两种不同颜色、且信号同样明亮、易于区分的生物发光“探针”。
为此，研究团队在《ACS Chemical Biology》上发表论文，报道了一项创新性工作。他们并非从零开始设计全新的荧光素酶，而是巧妙地对现有工具进行了“升级改造”。他们的核心思路是利用生物发光共振能量转移（BRET）原理。简单来说，BRET就像一场分子间的“能量接力”：一个发光的“供体”（此处是改造后的NanoLuc）将其激发能量，非辐射地传递给附近一个能吸收并重新发射不同颜色光的“受体”荧光团，最终实现发光颜色的“红移”。研究者们将一种经过“环状置换”（circularly permuted）处理的NanoLuc或LgBiT，精准地插入到自标记蛋白HaloTag的一个表面环中。HaloTag能够共价、特异地结合各种小分子荧光染料。这种精密的分子结构设计，使得供体与受体荧光团之间的距离和取向达到最优，实现了高达约90%的惊人BRET效率。他们将这种新型高效报告分子命名为“NanoPrism”荧光素酶。
这项研究的一个突出亮点在于其模块化和灵活性。NanoPrism不仅能作为完整的报告蛋白（PrismaLuc）使用，其二进制设计还支持高亲和力与低亲和力两种互补模式。高亲和力模式（基于LgBiT/HiBiT互补）适用于在HiBiT基因敲入细胞中检测内源表达的蛋白水平；而低亲和力模式（基于LgBiT/SmBiT互补）则可用于追踪可逆的蛋白质-蛋白质相互作用。通过将发射红光的NanoPrism（例如结合JF549荧光染料）与发射蓝光的原始NanoLuc或其互补变体配对，研究者成功构建了一个双色生物发光报告平台。这两种报告分子使用相同的底物，却能产生强度相近、但光谱分离超过100纳米的明亮信号，从而允许在同一个样品孔中进行定量、同步的双信号测量。
为了准确解析同一份样本中混合的两个颜色信号，研究者建立了一套校正策略。这套策略主要考虑并消除了两个干扰因素：一是蓝光信号向红光检测通道的“光谱渗漏”（spectral bleed-through），二是NanoPrism自身残留的蓝光（供体）发射。通过预先测定特定仪器和滤镜组合下的校正系数，他们能够从混合信号中精确地解卷积出分别来自NanoPrism（红光）和NanoLuc（蓝光）的独立信号，为后续的定量分析奠定了基础。
本研究采用了多种关键的技术方法来验证和展示其平台。核心是基于生物发光共振能量转移（BRET）的蛋白质工程改造，优化了NanoLuc在HaloTag中的插入位点和连接肽，以提升能量转移效率。平台构建后，利用光谱扫描和双通道滤光片成像在生化水平和活细胞中表征了其发光特性。在功能验证中，研究者应用了靶向蛋白质降解模型（使用PROTAC分子dBET6诱导BRD4降解）和生长因子信号通路模型（EGF诱导的EGFR信号传导与内化），在工程化的HEK293和HeLa细胞系中进行实验。数据分析则结合了微孔板读数器的群体平均测量和生物发光成像的单细胞可视化，并通过确定的校正因子进行信号解卷积。
研究结果部分展示了该平台在不同生物场景中的应用效能：
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工程化高效BRET报告分子
研究者通过系统筛选HaloTag的插入位点、NanoLuc的环化位点以及连接肽长度，优化出了PrismaLuc和PrismaLgBiT。生化表征显示，与简单的串联融合蛋白相比，NanoPrism与JF549荧光染料结合时，BRET效率从~30%大幅提升至接近90%。结构预测分析（使用Boltz-1X模型）表明，高BRET效率与cpNLuc和HaloTag结构域之间有利的平行排列取向相关。
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开发双色生物发光报告系统
在哺乳动物细胞中，PrismaLuc和与HiBiT互补的PrismaLgBiT均展现出高效的BRET驱动光谱红移，兼容多种Janelia Fluor系列HaloTag配体。研究者选定JF549染料用于后续实验，因其与NanoLuc有良好的光谱重叠以实现高效能量转移，同时其发射峰与NanoLuc的蓝光峰分离超过100纳米。他们进一步建立了针对不同检测仪器（读板器和成像仪）的信号解卷积校正方案，以准确分离双色信号。
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监测BRD4降解与内部对照
在靶向蛋白质降解应用中，研究团队在同一个样品中同时监测了降解靶标NLuc-BRD4和非降解对照蛋白（HiBiT标记的GAPDH或GSPT1）。通过将表达不同报告分子的细胞共培养或共表达于同一细胞系中，并应用PROTAC分子dBET6处理，他们成功追踪了BRD4的快速降解动力学（60分钟内达到最大降解），而对照蛋白信号保持稳定。微孔板读数与生物发光成像的结果高度一致，证明了该双色系统用于定量蛋白质降解分析的可靠性和实用性，并能校正由底物消耗等非特异性因素引起的信号衰减。
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监测EGFR信号传导、内化与降解
在EGF（表皮生长因子）信号通路模型中，该平台被用于解析同一通路中前后关联但不同的分子事件。首先，通过PrismaLgBiT与SmBiT的互补来报告EGF诱导的EGFR-Grb2相互作用，同时利用pH敏感的HiBiT/LgBiT互补来报告EGFR从细胞膜到酸性内体的内化过程，成功捕捉到相互作用先于内化的快速动力学。其次，通过共培养分别表达膜定位（报告内化）和胞质定位（报告降解）报告分子的细胞，该平台在同一个实验中同时解析了EGF诱导的EGFR快速内化和随后的缓慢降解过程，与已知的EGFR运输动力学相符。
在结论与讨论部分，该研究总结道，通过将NanoLuc报告分子与工程化的红移NanoPrism报告分子配对，他们成功开发了一个模块化的双色生物发光平台。该平台仅需单一底物，即可产生两种明亮且光谱分离良好的信号，并可通过标准读板器和成像仪进行检测与定量解卷积。其核心优势在于支持在同一个样品（无论是共培养细胞群还是单细胞内共表达）中实时、同步追踪两个分子读数。NanoPrism的二进制设计（支持高、低亲和力互补）极大地扩展了其应用范围，从内源蛋白的定量检测到可逆蛋白质相互作用的动态追踪。通过在蛋白质降解和受体运输等模型中的应用展示，该研究证明了此平台能够解析平行或连续的生物学事件，包括蛋白质丰度变化、通路相互作用和下游信号响应。群体平均的板式检测结果与生物发光成像分析结果的高度一致性，进一步验证了其信号解卷积策略的稳健性。总而言之，这项研究为解决多重生物发光检测的难题提供了一个简单、模块化且强大的解决方案，其与常规微孔板检测格式的兼容性，有望推动在样本有限的情况下进行更高通量的双色分析，为细胞生物学和药物发现研究提供了新的有力工具。
