优化镍、硒及氮源供应实现甲烷球菌大规模培养及其高效产甲烷性能研究

《ACS Omega》：Massive Cultivation of Methanococcus maripaludis Enabled by Optimized Ni, Se, and Nitrogen Supply

为解决传统培养基成本高、组分复杂且对中温产甲烷菌Methanococcus maripaludis大规模培养与产甲烷效率支持不足的问题，研究人员通过系统优化培养基中Ni、Se及NH4+浓度，开发了无有机添加的优化培养基MM2，并在2L生物反应器中验证了高密度培养与高效产甲烷性能。研究表明，优化后细胞密度提升2.13倍，甲烷产率(MPR)提升约25倍，最大干细胞重达15.2 g/L，反应器压力与进气流量显著影响甲烷产率与纯度。该研究为利用该遗传操作模型菌株进行规模化、经济高效的生物甲烷化技术提供了关键的培养基优化与工艺参数指导。

　　

在寻求可持续能源解决方案的道路上，将温室气体二氧化碳(CO₂)转化为高能量密度的甲烷(CH₄)——即生物甲烷化技术——提供了一条碳中性且温和的转化路径。其中，氢营养型产甲烷古菌能够利用氢气(H₂)和CO₂直接合成甲烷，尤其具有吸引力。然而，要实现工业化应用，必须克服两大瓶颈：一是需要开发支持微生物高密度、高效率生长的低成本、成分明确的培养基；二是需要在生物反应器规模上理解并优化工艺参数，以最大化甲烷产量。

作为模型生物之一，中温产甲烷古菌Methanococcus maripaludis因其遗传操作便利性和相对较高的比生长速率而备受关注。但此前，针对该菌株的大规模培养研究有限，传统的复杂培养基（如DSMZ 141）含有酵母提取物、胰蛋白胨等有机成分，不仅成本高昂，也引入了培养条件的可变性。在已有报道中，该菌株能达到的生物量浓度也相对较低。因此，系统优化其培养基组成，并探究反应器规模下的放大培养性能，对于推动其生物技术应用至关重要。

本项研究旨在填补这一空白。研究人员通过调整培养基中关键的微量元素（镍Ni、硒Se）和氮源（铵NH₄⁺）的浓度，显著提升了M. maripaludis的生长和产甲烷能力，并成功在2L生物反应器中实现了高密度培养，系统考察了压力和气体流速对产甲烷性能的影响。相关研究成果已发表于学术期刊《ACS Omega》。

为开展本研究，研究人员主要采用了以下几项关键技术方法：首先，在密闭血清瓶批次培养体系中，通过单因素实验系统评估了不同浓度的硒(以Na₂SeO₃形式)、镍(以NiCl₂·6H₂O形式)、其他微量元素(TME No. 151溶液)和氯化铵(NH₄Cl)对菌体生长光密度(OD₆₀₀)和甲烷产率(MPR)的影响。其次，基于优化结果配制了无有机添加的MM2优化培养基，并与去除有机成分的DSMZ 141培养基进行长期驯化和对比培养实验。最后，研究进行了放大实验，在2L生物反应器中使用5倍浓缩微量元素版的MM2-5×培养基进行培养，通过连续补料策略维持高密度生长，并系统改变了反应器操作压力（0.3, 0.5, 0.75, 1.0 barg，表压）和进气流量（0.5, 0.75, 1.0 L/min），以评估这些物理参数对甲烷产率(MPR)、出口气体甲烷浓度(CH₄%)、比甲烷生产率(q_CH4)和CO₂转化率的影响。实验过程中使用气相色谱(GC)分析气体成分，并依据OD₆₀₀与干细胞重(DCW)的换算关系监测生物量。

3.1. Ni和Se对M. maripaludis生长和MPR的影响

研究人员首先探究了镍(Ni)和硒(Se)的可利用性。实验表明，两者对M. maripaludis的生长和产甲烷都至关重要。缺乏任一组分都会限制生长，而同时补充两者对细胞生长和甲烷产率(MPR)表现出协同促进作用，能获得最高的OD₆₀₀和MPR值。在测试的浓度范围内（Na₂SeO₃0.25–1.0 mg/L，NiCl₂·6H₂O 0.75–1.6 mg/L），过量补充并未带来性能的进一步提升。基于此，后续实验选择了0.75 mg/L的Ni和0.25–0.5 mg/L的Se作为优化浓度。文中从酶学角度进行了解释：镍是甲基辅酶M还原酶(MCR)及其辅因子F₄₃₀等关键产甲烷酶的核心组分；硒则被掺入硒代半胱氨酸酶（如甲酸脱氢酶Fwd）中，在硒充足条件下，其硒非依赖型同工酶系统被抑制，这或许解释了该菌在缺硒条件下比缺镍条件下生长更好的原因。

3.2. 其他微量元素对M. maripaludis生长的影响

在改变其他微量元素(TME No. 151)浓度的实验中，即使在不添加任何TME的对照组中，M. maripaludis仍能健康生长，表明该生物能耐受补充性微量元素的缺失。在1倍至6倍TME浓度范围内，OD₆₀₀值无显著差异，说明在所测试的批次条件下，微量元素水平的适度变化对生长影响不大。但研究者也指出，这些结论基于单次实验，需谨慎解读。

3.3. 铵对M. maripaludis生长和MPR的影响

铵浓度实验显示，将NH₄Cl浓度从0.25 g/L（DSMZ 141推荐量）提高至1.0 g/L，可以改善M. maripaludis的生长。然而，当浓度提升至10 g/L及以上时，观察到生长抑制，在25和30 g/L时抑制尤为严重，表明高浓度铵存在毒性。在批次小瓶实验中，当生物量足够时，甲烷产率(MPR)似乎受到氢气可用性（气体传质）而非生物量水平的限制，因为提高气体压力（从2.5 barg增至3.5 barg）使MPR增加了21–26%。因此，1.0 g/L NH₄Cl被确定为生物量积累的最佳浓度。

3.4. 优化培养基MM2与常规培养基在密闭批次培养中的比较

基于上述优化，研究开发了MM2培养基（含1.0 g/L NH₄Cl, 0.5 mg/L Na₂SeO₃, 0.75 mg/L NiCl₂·6H₂O）。与去除有机成分的DSMZ 141培养基相比，经过长期驯化的MM2培养物表现出显著更优的生长和MPR。MM2培养物最大OD₆₀₀达6.38，最大比生长速率(μ)为0.81 h^–1，MPR为1.77 L_CH4/L_culture/h；而DSMZ 141组相应值分别为2.04、0.37 h^–1和0.75 L_CH4/L_culture/h。这表明，仅通过优化无机营养成分，就能实现生物量和产甲烷性能的大幅提升。

3.5. M. maripaludis在2L生物反应器中的放大性能测试

在2L生物反应器中使用MM2-5×培养基进行培养，并通过连续补加100倍浓缩培养基（不含NaHCO₃和NaCl）的策略，成功将M. maripaludis的干细胞重(DCW)提升至15.2 g/L，显示了高密度培养的可行性。

3.6. 压力和气体流速对MPR和CH₄%的影响

在稳态培养阶段，系统改变操作参数发现，在固定气体流速(0.5 L/min)下，提高反应器压力能同时提升甲烷产率(MPR)和出口气体中的甲烷浓度(CH₄%)。压力从0 barg增至1.0 barg时，MPR从约3.60升至5.58 L_CH4/L_culture/h，CH₄%从23.00%升至72.80%，CO₂转化率也从60.30%改善至93.05%。而在常压下，提高进气流量（从0.5 L/min增至1.0 L/min）虽然使MPR从3.60升至4.70 L_CH4/L_culture/h，但CH₄%却从23.00%下降至11.40%，这可能是由于气体停留时间缩短和未转化H₂/CO₂的稀释效应所致。

3.7. 压力和气体流速对q_CH4的影响

比甲烷生产率(q_CH4，即单位生物量的甲烷产率)同样随压力和气体流速的增加而呈线性上升。压力从0 barg增至1 barg，q_CH4从0.25升至0.39 L_CH4/g/h；气体流速从0.5 L/min增至1.0 L/min，q_CH4从0.25升至0.33 L_CH4/g/h。这一线性关系表明，培养体系受气体底物限制，优化压力和流量是提高微生物催化效率的关键。

本研究通过系统优化培养基中的镍、硒和铵浓度，成功开发了适用于Methanococcus maripaludis高效培养的无有机添加优化培养基MM2。该培养基在批次培养中使细胞密度提升了2.13倍，甲烷产率(MPR)提升了约25倍。在2L生物反应器规模上，通过补料策略实现了高达15.2 g/L的干细胞重，证明了高密度培养的可行性。研究进一步明确了操作参数的关键影响：提高反应器压力可同时显著提升甲烷产率、甲烷纯度和CO₂转化率；而增加进气流量虽能提高甲烷产率，却会因稀释效应降低出口甲烷浓度。比甲烷生产率(q_CH4)与压力、流量均呈正相关，证实了体系受气体底物传输限制。

这项工作的意义在于，它突破了传统复杂培养基对M. maripaludis培养的限制，通过精准优化关键无机营养成分，大幅提升了其生长和产甲烷性能，为降低生物甲烷化工艺成本奠定了基础。同时，在生物反应器水平上揭示的压力和气体传质的关键作用，为今后该菌株乃至其他氢营养型产甲烷菌的工业化放大与工艺优化提供了直接、实用的数据支持和理论依据。研究结果凸显了通常使用的培养基“可用但非最优”的现状，强调了针对特定菌株进行培养基和工艺系统性优化的必要性，为推动高效、可持续的生物甲烷化技术发展迈出了坚实的一步。