序列异构体组装“对决”：两亲性肽的褶皱与波纹状β-折叠片层结构比较研究

《Biochemistry》：Comparison of Pleated and Rippled β-Sheet Assembly of Sequence Isomers of an Amphipathic Self-Assembling Peptide

《Biochemistry》特刊精选：针对传统褶皱β-折叠纳米材料组装效率与构型灵活性的瓶颈，以及新兴的保罗林-科里波纹状β-折叠结构认知不足的问题，本项研究通过对比具有相同氨基酸组成但序列排列不同的两亲性自组装肽（L1-L5及其对映体），结合实验与计算模拟，揭示了手性混合物共组装成波纹状β-折叠的显著热力学优势和结构独特性，为设计下一代具有特定结构与功能的手性多样化生物材料提供了新范式。

　　

在生命科学和材料科学的前沿交叉领域，由多肽自组装形成的β-折叠纳米结构一直是研究的焦点。这类结构不仅是阿尔茨海默症、帕金森病等淀粉样蛋白病的病理基础，也因其卓越的机械性能和可编程性，在组织工程、再生医学和抗菌设计等应用领域展现出巨大潜力。自然界中存在的经典“褶皱β-折叠”，其肽链以延展的β-链构象平行或反平行排列，侧链交错重叠，形成独特的褶皱图案。然而，这类由单一手性（L-或D-）肽自组装形成的结构，其组装效率和最终形态往往受限于特定的氨基酸序列模式，限制了材料设计的自由度。

早在1953年，结构生物学巨擘莱纳斯·保罗林和罗伯特·科里就提出了一个大胆的猜想：如果等摩尔混合L-型和D-型对映体肽，它们可能会形成一种与天然褶皱结构完全不同的“波纹状β-折叠”。在这种结构中，L-肽和D-肽以交替方式排列，侧链形成交错的锯齿形“波纹”模式。尽管这一构想极具吸引力，但由于在自然界中难以自发形成，波纹状β-折叠在长达半个多世纪里一直停留在理论假设阶段，对其形成条件、稳定性和结构特性的理解远落后于经典的褶皱β-折叠。近年来，随着合成生物学和超分子化学的发展，研究者们开始在设计的体系中观察到支持波纹状β-折叠形成的证据，但其形成的普适性规律，特别是氨基酸序列顺序对波纹状与褶皱β-折叠组装竞争的影响，仍然是一个亟待探索的谜题。

为了解开这个谜题，并为设计性能更优的生物材料开辟新道路，一项发表在《Biochemistry》期刊“肽的化学与生物学”特刊上的研究，对一系列具有相同氨基酸组成但序列排列各异的模型肽进行了系统性探究。研究人员之前已经深入研究了五个序列异构体（Ac-(FKFE)₂-NH₂(L1)、Ac-(FK)₂(FE)₂-NH₂(L2)、Ac-KE(F)₄KE-NH₂(L3)、Ac-(KFFE)₂-NH₂(L4)和Ac-FF(KE)₂FF-NH₂(L5)）的褶皱β-折叠自组装行为。本次研究则将视野扩展至这些肽与其D-型对映体（D1-D5）的等摩尔混合物，旨在回答一个核心问题：与单一对映体自组装成褶皱β-折叠相比，手性混合物共组装成波纹状β-折叠的倾向性有多大？序列顺序的改变又如何影响这种竞争？

为了全面探究上述科学问题，研究人员整合了多种实验与计算技术。在实验层面，他们采用了固相肽合成法制备并纯化了所有目标肽序列及其同位素标记变体。核心表征技术包括：傅里叶变换红外光谱用于监测β-折叠二级结构的形成与演变；透射电子显微镜用于观察和比较褶皱与波纹状β-折叠组装体的纳米形貌差异；沉降分析结合高效液相色谱用于测定临界聚集浓度，从而定量比较不同组装过程的热力学驱动力；以及同位素编辑红外光谱，通过引入¹³C标记的氨基酸，为波纹状β-折叠中交替的L-/D-链排列提供了关键的结构证据。在计算层面，研究团队进行了全原子分子动力学模拟，在微观尺度上揭示了手性混合物中肽链的相互作用和组装动力学，为实验观察提供了理论补充。

结果

实验设计

研究重新审视了L1-L5及其D-对映体。这些肽拥有完全相同的氨基酸组成（苯丙氨酸F、赖氨酸K、谷氨酸E），但序列模式不同：L1和L2保持了交替的疏水/亲水模式，L3将四个苯丙氨酸簇集在肽链中央，L4和L5则具有以不同方式对称分布的苯丙氨酸二聚体。此前的研究已表明，它们在褶皱β-折叠自组装能力上存在显著差异：L1 ≈ L2 > L3 ? L4 ≈ L5。本研究旨在比较这些单一L-型肽的褶皱β-折叠自组装与其L/D混合物的波纹状β-折叠共组装之间的相对倾向性。

傅里叶变换红外光谱表征β-折叠二级结构

FTIR光谱分析显示，在相同总肽浓度下，所有L/D混合物（L1/D1至L5/D5）形成β-折叠结构的倾向性均显著高于其对应的单一L-型肽。例如，L3在1 mM时FTIR谱显示主要为无规结构，而L3/D3混合物在相同总浓度下则显示出强烈的β-折叠特征峰。对于自组装能力很弱的L4和L5，其单一肽溶液即使在4 mM的高浓度下也几乎检测不到β-折叠信号，但它们的L/D混合物在2 mM或4 mM时则能形成明显的β-折叠结构。这表明手性混合物的共组装在热力学上比单一手性肽的自组装更为有利。

透射电子显微镜比较褶皱与波纹状β-折叠组装体的形貌

TEM成像进一步证实了波纹状β-折叠的形成，并揭示了其与褶皱β-折叠在纳米结构上的根本差异。例如，L1自组装形成典型的螺旋纳米带和纳米管，而L1/D1共组装则形成宽度约为前者一半、形貌不规则的纤维。L3形成宽而扭曲的纳米带，而L3/D3则形成更细、无扭曲的纤维。L4和L5的自组装体形貌不规则或呈球状，而其L/D混合物则能形成明确的纤维结构。这些显著的形貌差异强有力地支持了L/D混合物发生了共组装，形成了结构独特的波纹状β-折叠，而非简单地自我分选成各自手性的褶皱β-折叠。

同位素编辑傅里叶变换红外光谱支持波纹状β-折叠中的L/D排列

为了从分子排列层面证实波纹状β-折叠的交替L/D结构，研究采用了IE-IR技术。他们在L1、L2、L3的特定苯丙氨酸残基的羰基碳上引入¹³C标记。当在L-肽上引入两个可产生耦合效应的¹³C标记时，其自组装的褶皱β-折叠FTIR谱会在更低波数出现一个耦合峰。然而，当将此双标记的L-肽与未标记的D-对映体混合组装时，耦合峰消失，谱图特征与未耦合的单标记体系相似。这一结果清晰地表明，在组装的β-折叠中，标记的L-链与未标记的D-链是交替排列的，从而打断了L-链之间的同位素耦合，为波纹状β-折叠的交替排列模型提供了确凿的实验证据。

褶皱β-折叠自组装与波纹状β-折叠共组装的热力学比较

通过沉降分析测定临界聚集浓度（C_r），研究定量比较了组装过程的热力学。结果显示，所有对应的L/D混合物（波纹状β-折叠）的C_r值都远低于其单一L-型肽（褶皱β-折叠）的C_r值。计算得到的吉布斯自由能变（ΔΔG）表明，形成波纹状β-折叠比形成褶皱β-折叠在热力学上更有利，优势在0.9到1.7 kcal mol^-1之间。其中，对于自组装能力本已很强的L1和L2，其L/D混合物共组装优势约为1.6和1.3 kcal mol^-1；而对于自组装能力很弱的L3、L4和L5，其L/D混合物的共组装优势反而更大（分别约为1.7、1.2和0.9 kcal mol^-1），使得L3/D3混合物的C_r值甚至低于高效自组装的L1。这从热力学角度无可辩驳地证明了波纹状β-折叠形成的普适性优势。

全原子分子动力学模拟研究褶皱与波纹状β-折叠组装

分子动力学模拟为实验结果提供了微观层面的解释。模拟追踪了体系中肽链间主链氢键数量、手性接触分数以及最终组装的纳米纤维结构。结果显示，所有L/D混合体系的肽链间氢键形成速度均快于或类似于其对应的单一L-型体系。特别是，在模拟结束时，L3/D3、L4/D4和L5/D5混合体系形成了显著的交叉β结构，而其对应的单一L-型体系则未能形成或仅形成有限的结构。模拟还观察到了交替的L/D链排列，与波纹状β-折叠模型一致。这些计算结果表明，手性混合降低了肽链在组装过程中的立体位阻，使得即使对于不易形成褶皱β-折叠的序列，也能通过共组装形成稳定的波纹状β-折叠结构。

结论与讨论

这项综合性的研究有力地扩展了我们对波纹状β-折叠这一古老概念的理解边界。研究表明，对于一系列具有不同序列模式的两亲性肽，其L-型和D-型对映体的等摩尔混合物，相比于单一对映体，具有普遍更高的倾向性共组装成波纹状β-折叠。这种优势体现在多个层面：在二级结构水平，FTIR显示β-折叠信号更强、形成更快；在形貌水平，TEM揭示了截然不同的、更细或更不规则的纳米纤维结构；在分子排列水平，IE-IR提供了交替L/D链排列的直接证据；在热力学水平，沉降分析定量证明了更低的临界聚集浓度和更大的负吉布斯自由能变；在理论模拟水平，分子动力学揭示了更快的氢键形成动力学和更稳定的组装结构。

研究的重要意义在于，它系统性地证明了波纹状β-折叠的形成并非个别序列的偶然现象，而可能是一个普适性的组装原理。尤其值得注意的是，对于那些由于其序列模式（如疏水残基不呈交替分布）而导致褶皱β-折叠自组装能力很弱的肽，一旦与其对映体混合，便能“化腐朽为神奇”，高效地组装成有序的波纹状β-折叠纳米结构。这极大地拓展了可用于设计自组装生物材料的肽序列库，打破了传统褶皱β-折叠对“理想”两亲交替序列的依赖。

该研究将保罗林和科里在70年前的理论预言，转化为具有明确实验和计算证据支持的设计范式。它强调了在肽基生物材料设计中利用手性多样性（即同时使用L-和D-型氨基酸）的策略价值。通过精确调控序列和手性，研究人员现在可以更有目的地设计出具有特定纳米形貌、力学性能和生物稳定性的“波纹状”材料，为开发下一代用于药物递送、组织支架、抗菌涂层等领域的先进生物材料开辟了全新的、充满潜力的道路。这项研究标志着对β-折叠超分子结构理解的一个重要进步，并将启发更多关于手性在生命过程和材料科学中作用的基础与应用研究。