《International Journal of Surgery》：Potential of RAD51C as a hub gene and therapeutic target in bladder cancer: insights from bioinformatics and experimental analysis
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膀胱癌的免疫治疗抵抗是临床上面临的重大挑战。本研究围绕转录因子CREB1/c-Jun的靶基因网络，首次通过多组学与机器学习筛选出20个关键特征基因（Hub-CR.Sig），并揭示其中RAD51C是驱动肿瘤恶性表型、预后不良的关键因子。实验证实，靶向RAD51C可显著抑制膀胱癌细胞增殖、侵袭、DNA修复及体内成瘤能力，并与JAK-STAT通路及新型RAD51C+成纤维细胞相关联。该研究为膀胱癌的免疫治疗分型、预后评估及靶向RAD51C的治疗策略提供了新见解。
在全球肿瘤发病率不断攀升的背景下，免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Inhibitors, ICIs）已经成为治疗多种晚期肿瘤的主流方法。然而，尽管在一些患者中取得了显著疗效，但仍有相当一部分患者对免疫治疗无反应或产生耐药性，这构成了当前肿瘤免疫治疗领域亟待突破的“阿喀琉斯之踵”。膀胱癌作为泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，同样面临着免疫治疗反应的巨大个体差异。深入探索免疫治疗抵抗的分子机制，寻找能够预测疗效和逆转耐药的关键靶点，成为推动精准免疫治疗、改善患者预后的核心科学问题。转录因子作为基因表达的“总开关”，在肿瘤发生、发展和免疫逃逸中扮演着关键角色。其中，cAMP反应元件结合蛋白1（cAMP response element-binding protein 1, CREB1）和原癌基因c-Jun的协同作用，被发现能够共同调控一系列下游基因，影响肿瘤细胞的恶性行为并塑造免疫抑制性微环境。那么，在膀胱癌中，由CREB1和c-Jun共同调控的靶基因网络究竟扮演着怎样的角色？其中是否隐藏着决定免疫治疗命运的关键“枢纽”？
为回答这些问题，一支研究团队在《International Journal of Surgery》上发表了一项综合性研究。他们巧妙地构建了一个从“宏观”到“微观”、从“计算”到“实验”的研究体系，旨在系统解析CREB1/c-Jun调控网络在膀胱癌中的作用，并从中挖掘出最具潜力的治疗靶点。研究者们首先从分子特征数据库（Molecular Signatures Database, MSigDB）中获取了已验证的CREB1/c-Jun共同靶基因集，并结合来自皮肤黑色素瘤和基底细胞癌的单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）数据分析，发现这些靶基因的激活与免疫治疗无响应状态显著相关，且高度富集于恶性肿瘤细胞中。通过整合34个恶性癌症的单细胞数据集，他们筛选出116个与CREB-c-Jun相关的差异表达基因（CR.Sig）。随后，研究团队运用了包括Bagged Trees、贝叶斯方法、学习矢量量化、Boruta、LASSO回归和随机森林在内的六种机器学习算法，对来自五个独立ICI RNA-Seq队列的数据进行分析，最终精炼出20个在至少三种算法中一致出现的核心特征基因，称为Hub-CR.Sig。这20个基因构成了后续研究的基石。
关键技术方法概览：本研究整合了多种生物信息学分析与实验验证技术。在计算方面，主要利用了来自公共数据库（如TCGA、GEO、TISCH）的批量转录组和单细胞RNA测序数据，通过机器学习进行特征基因筛选和预后模型构建。在实验方面，研究者收集了来自上海交通大学医学院附属瑞金医院的26对膀胱癌临床样本队列，并通过免疫组化、蛋白质印迹（Western Blot）进行靶点验证。功能实验则采用了在膀胱癌细胞系（5637）中敲低靶基因（shRNA）、CCK-8、克隆形成、Transwell侵袭、伤口愈合、彗星实验（Comet assay）等一系列体外模型，以及基于裸鼠的异种移植瘤模型进行体内功能验证。RNA测序用于分析基因敲低后的转录组变化。
研究结果：
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Hub-CR.Sig的筛选与验证：研究证实，基于20个Hub-CR.Sig构建的风险评分模型能够有效预测膀胱癌患者的预后，高风险组总体生存期更短。此外，依据这些基因的表达谱，可以将膀胱癌患者分为两个具有不同分子特征的亚型（Cluster 1和Cluster 2），这两个亚型在免疫治疗排斥（TIDE）评分、体细胞突变谱和潜在有效药物靶点类别上均存在显著差异，为膀胱癌的精准分型提供了新依据。
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核心枢纽基因RAD51C的临床与功能解析：在20个Hub-CR.Sig中，RAD51C脱颖而出。生物信息学分析显示，RAD51C在膀胱癌组织中表达显著高于癌旁正常组织，其高表达与更晚的T分期（T3/T4）、远处转移（M1）以及更差的总体生存率密切相关。双荧光素酶报告基因实验证实了转录因子c-Jun可直接结合并调控RAD51C的启动子活性。临床样本的免疫组化和蛋白质印迹结果一致验证了RAD51C蛋白在膀胱癌中的高表达。
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RAD51C的促癌功能机制：在膀胱癌细胞中敲低RAD51C的表达，产生了多方面的抑癌效果：
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抑制恶性表型：显著降低了癌细胞的增殖活性、克隆形成能力、侵袭和迁移能力。
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损伤DNA修复：彗星实验表明，敲低RAD51C导致DNA损伤修复能力严重受损。
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影响相关信号通路：蛋白质印迹显示，敲低RAD51C后，促凋亡蛋白BAX上调，抗凋亡蛋白BCL-2下调，同时DNA损伤标志物p-H2A.X和p-ATM表达增加，细胞周期调控蛋白CDK7表达降低。
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体内抑制肿瘤生长：在裸鼠皮下成瘤实验中，敲低RAD51C的癌细胞形成的肿瘤体积和重量均显著小于对照组，且肿瘤组织内细胞增殖标志物Ki-67表达降低，细胞凋亡（TUNEL阳性）增加，胶原纤维沉积增多。
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RAD51C缺失的转录组学变化：对敲低RAD51C的癌细胞进行RNA测序分析发现，差异表达基因显著富集于JAK-STAT信号通路、TGF-β信号通路以及Notch信号通路等。这提示RAD51C可能通过调节这些关键信号通路来影响肿瘤细胞的行为和微环境。
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肿瘤微环境中的新发现：RAD51C+成纤维细胞：一个有趣的发现是，RAD51C不仅在肿瘤细胞中高表达，在肿瘤相关成纤维细胞（Cancer-Associated Fibroblasts, CAFs）中也有显著表达。通过多重免疫组化，研究者首次定义了一类RAD51C+成纤维细胞。临床数据分析显示，这类成纤维细胞的高丰度与膀胱癌肿瘤浸润深度（侵犯肌层及以外）显著相关。在构建的小鼠原位膀胱癌模型中也观察到了类似现象，当肿瘤侵犯至肌层以上时，成纤维细胞中的RAD51C表达明显增加。这揭示了RAD51C在肿瘤微环境细胞交互中的作用。
结论与意义：本研究通过系统的生物信息学挖掘与多层次的实验验证，首次建立了基于CREB1/c-Jun转录因子靶基因网络（Hub-CR.Sig）的膀胱癌预后与免疫治疗反应分类器，并从中成功鉴定出RAD51C为核心驱动基因。研究证实，RAD51C的高表达是膀胱癌恶性进展和不良预后的关键因素，其功能涉及促进癌细胞增殖、侵袭、迁移和DNA损伤修复。靶向抑制RAD51C能在体内外有效抑制膀胱癌生长。更重要的是，研究发现了RAD51C在肿瘤微环境中新型成纤维细胞亚群（RAD51C+成纤维细胞）中的特异性表达，且该亚群与肿瘤的深层浸润相关，为理解肿瘤-间质相互作用提供了新视角。该研究不仅为膀胱癌患者提供了新的潜在预后生物标志物和治疗靶点（RAD51C），也为基于特定转录因子调控网络进行肿瘤分型和个性化治疗策略的开发提供了创新性的研究范式。研究者指出，未来需要扩大临床样本队列进行验证，并深入探索RAD51C影响JAK-STAT等信号通路及肿瘤微环境的具体分子机制，以加速其向临床应用的转化。
