《Veterinary Research Communications》：First report of serological and molecular detection of influenza A (H1N1) in European bison (Bison bonasus)
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本刊荐文：鉴于野生反刍动物甲型流感病毒感染数据缺乏，研究人员针对欧洲野牛（欧洲最大陆生哺乳动物）开展了一项回顾性研究。通过ELISA、RT-qPCR和Sanger测序等技术，首次在圈养个体中发现了A/H1N1pdm病毒RNA及抗体，血清阳性率为0.3%。该研究证实了欧洲野牛对该病毒的易感性，强调了野生动物-家畜界面的流感生态学研究重要性。
在欧洲广阔的森林与原野中，生活着一种体型庞大的“森林之王”——欧洲野牛（Bison bonasus）。作为欧洲现存最大的陆生哺乳动物，它们不仅是生态系统健康的关键指示物种，也是生物多样性保护的重要象征。然而，这位森林巨人在面临病毒威胁时，其健康状况却鲜为人知。特别是像甲型流感病毒（Influenza A virus, IAV）这样的人畜共患病原体，它能感染包括人类、猪、禽类在内的多种宿主，但长期以来，科学界对其在野生反刍动物，尤其是像欧洲野牛这样的濒危大型物种中的感染情况知之甚少。鉴于流感病毒跨物种传播（spillover）的风险，以及全球不断变化的生态与农业环境，了解流感病毒在野生动物与家畜界面（wildlife–livestock interface）的传播动态，对于保护濒危物种、防范人畜共患病以及保障畜牧业健康都至关重要。这便引出了一个关键的科学问题：作为欧洲标志性的野生有蹄类动物，欧洲野牛是否也会感染并成为流感病毒的宿主？为了回答这个问题，一项聚焦于欧洲野牛的前瞻性研究于近期展开，其成果发表在《Veterinary Research Communications》上。
为了评估欧洲野牛群体中甲型流感病毒的感染状况，研究人员从2017年至2023年间收集了335份血清样本。这些样本来自圈养和自由放养的野牛群体，覆盖了不同年龄和性别。研究方法采用了一种“血清学筛查为先，核酸确认为辅”的策略。首先，使用一种商业化的、可检测针对所有甲型流感病毒亚型抗体的ELISA试剂盒对血清进行筛查。在发现ELISA阳性样本后，研究人员获取了该阳性个体的心脏和肝脏组织样本。接着，利用逆转录实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）技术，特异性检测组织中是否含有甲型流感病毒H1N1pdm亚型、H3N2亚型及H5N1亚型的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）基因。最后，对RT-qPCR阳性产物进行Sanger测序，并将获得的基因序列与公共数据库进行比对，以确认病毒身份。
研究结果
血清阳性率
通过对335份样本的ELISA检测，甲型流感病毒在野牛群体中的血清阳性率为0.3%（1/335）。唯一呈阳性的个体是一只来自波雷茨卡森林（Borecka Forest，Wolisko）圈养种群的4岁雄性野牛，于2018年因包皮炎（posthitis）被扑杀。尸检显示该野牛身体状况不佳，存在肺充血、肺气肿和包皮炎。
RT-qPCR检测甲型流感病毒
研究人员在ELISA阳性个体的心脏和肝脏组织中均检测到了甲型流感病毒A/H1N1pdm亚型的RNA。具体而言，心脏组织中H1和N1基因的Ct值分别为23.36和26.98；肝脏组织中H1和N1基因的Ct值分别为28.83和37.32。
A/H1N1 RNA测序
对RT-qPCR扩增产物进行Sanger测序，获得了血凝素基因（56 bp）和神经氨酸酶基因（72 bp）的短片段序列。通过BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）分析，这两个短片段序列与GenBank数据库中已存的甲型流感A(H1N1)病毒序列均显示出100%的序列一致性和100%的覆盖度，从而在分子水平上确认了感染病毒为A/H1N1pdm亚型。
结论与讨论
这项研究首次从分子和血清学层面证实了欧洲野牛能够感染甲型流感病毒（具体为A/H1N1pdm亚型），这是理解流感病毒在野生反刍动物中流行病学特征的重要进展。研究结果显示，尽管总体感染率很低（0.3%），呈散发性事件，但这明确指出了欧洲野牛对该病毒具有潜在的易感性。
阳性个体为圈养野牛，这提示了可能的感染来源。由于H1N1病毒主要在人类中流行，且该野牛生活在管理环境中，因此不能排除与人类接触或通过共享环境发生间接暴露的可能性。这表明了在野生动物-家畜-人类界面存在复杂的病毒传播网络。
从技术层面看，本研究采用的“血清学初筛-核酸检测确认”策略，非常适合基于机会性采样的野生动物监测。在病毒载量可能较低、样本可能降解的野生动物尸检材料中，通过RT-qPCR结合短片段Sanger测序进行确认，是获得可靠诊断证据的务实方法。尽管在心脏和肝脏等非流感病毒主要靶器官中检测到病毒RNA，但在严重或全身性感染，尤其是死亡后检测中，这并非罕见现象，与团队之前在猫和雪貂中的发现一致。
这项发现具有重要的“一体化健康”（One Health）意义。在欧洲野牛这一大型野生反刍动物中确认自然感染A/H1N1病毒，为牛科动物（Bovidae）存在跨物种病毒感染风险提供了一个早期数据点。尤其在2024年美国发生H5N1高致病性禽流感在奶牛中暴发之前，这项研究就已提示大型反刍动物对流感病毒的易感性，相关发现与近期在反刍动物中检出人类和猪源流感病毒抗体的血清学研究相互印证。
综上所述，本研究不仅填补了关于欧洲野牛作为流感病毒宿主知识的空白，也强调了在野生动物-家畜界面持续进行流感病毒监测与研究的重要性。对于欧洲野牛这一具有重要生态与保护价值的物种，了解其对新发传染病的易感性，是制定有效保护策略和防范公共卫生风险的科学基础。
