《Veterinary Research Communications》：Molecular identification with virulence gene profiles and in-vitro antifungal susceptibility of Candida species associated with subclinical mastitis in Anatolian buffaloes and dairy cows
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本文聚焦于乳腺炎这一严重影响奶畜健康和经济的重要疾病，揭示了真菌尤其是念珠菌属的作用长期未受到充分重视。研究人员针对安纳托利亚水牛和奶牛，首次在土耳其地区对亚临床乳腺炎相关的念珠菌进行了分子水平的物种鉴定、毒力基因（ALS1, SAP1, PLB1）分析和抗真菌药敏测试。研究发现，非白色念珠菌（Non-albicans Candida， NAC）在两类宿主中都占主导地位，首次提供了土耳其地区源自水牛乳腺炎分离株中SAP1毒力基因的分子证据，并且分离株普遍对多种抗真菌药物敏感性降低。这项研究强调了物种水平精确鉴定的重要性，为基于诊断的乳腺炎管理策略提供了区域特异性基线数据。
乳腺炎是一种令奶农和兽医工作者头疼的“奶牛乳房炎”，它不仅影响动物福利，还直接导致产奶量下降、奶品质恶化，给畜牧业带来巨大的经济损失。长期以来，细菌被认为是乳腺炎最主要的“元凶”，相关的研究和控制措施也多围绕它们展开。然而，在这些“主流”病原体之外，真菌（特别是念珠菌属）导致的乳腺炎，像一个被忽略的“影子”，其真实发生率、病原谱系、致病性以及对治疗的响应情况，尤其是在水牛这一重要奶畜中，研究数据还非常有限。随着诊断技术的进步和抗真菌药物的使用，厘清酵母菌在乳腺炎中的角色变得越来越迫切。为了解决这些问题，一支研究团队将目光投向了土耳其安纳托利亚地区的水牛和奶牛，开展了一项深入的研究。他们的研究成果发表在《Veterinary Research Communications》期刊上。
为了回答上述问题，研究人员首先从当地小型农场采集了样品（共301头水牛的1188个乳区和332头奶牛的1321个乳区，均确诊为亚临床乳腺炎）。然后，他们运用了一系列技术手段：通过加州乳腺炎测试（CMT）进行炎症筛选；利用沙氏培养基（Sabouraud Dextrose Agar）和显色念珠菌琼脂（Chromogenic Candida Agar）进行表型分离与初步鉴定；设计并应用了针对内转录间隔区（ITS）的PCR引物进行属级分子确认，并结合Sanger测序进行物种水平鉴定与系统发育分析；对鉴定出的白色念珠菌（C. albicans）分离株，采用PCR方法检测了三种关键的毒力基因（ALS1， SAP1， PLB1）；最后，采用纸片扩散法（Kirby-Bauer disk diffusion method）对分离株进行了七种常用抗真菌药物的敏感性测试。这些方法共同构建了一个从表型到基因型、从鉴定到抗性评估的完整研究路径。
研究结果
分离结果
从水牛的93份样本（阳性率7.83%）和奶牛的99份样本（阳性率7.49%）中总共分离到192株念珠菌属疑似菌株。两种宿主的分离率相近，表明酵母菌引起的乳腺内感染在两种动物中都应得到重视。
加州乳腺炎试验（CMT）评分与念珠菌分离的关联
统计分析显示，无论是水牛还是奶牛，其CMT评分类别与念珠菌的检出之间存在显著的统计学关联。然而，相当一部分酵母阳性的乳区出现在CMT阴性或低分值类别，这表明真菌性乳腺内感染可能并不总是能引发被常规现场筛查试验所检测到的炎症反应。
念珠菌分离株的物种水平鉴定结果
通过测序进行物种鉴定发现，在两类宿主中最常分离到的物种都是库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii， 即旧称克鲁斯念珠菌Candida krusei）和马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus， 即旧称乳酒念珠菌Candida kefyr）。在192株分离株中，有190株（98.96%）属于非白色念珠菌（NAC）物种。白色念珠菌仅在来自水牛的样本中检测到（2/93； 2.15%），在奶牛样本中则未检出。这一结果凸显了NAC物种在真菌性乳腺炎流行病学中日益重要的作用。
系统发育分析结果
基于ITS序列的系统发育分析构建了进化树，直观地展示了从水牛和奶牛中鉴定出的念珠菌物种之间的亲缘关系。分离株根据物种清晰地聚集，例如C. rugosa、K. marxianus (C. kefyr)、C. albicans等各自形成独立的聚类分支，这从分子系统学角度验证了物种鉴定的准确性。
毒力基因检测结果
PCR筛查显示，从水牛中分离到的两株白色念珠菌都携带SAP1毒力基因，而ALS1和PLB1基因在这两株菌中均未检测到。尽管分离株数量有限，但这是土耳其地区首次提供源自水牛乳腺炎分离株中存在SAP1基因的分子证据，暗示了其潜在的毒力特征。
抗真菌药敏结果
抗真菌药敏试验揭示了分离株普遍存在的耐药性。来自水牛的分离株对氟胞嘧啶（flucytosine）全部耐药，对伊曲康唑（itraconazole， 98.9%）、两性霉素B（amphotericin B， 88.2%）、卡泊芬净（caspofungin， 86.0%）和氟康唑（fluconazole， 83.9%）也表现出高耐药率。奶牛来源的分离株对伊曲康唑和氟胞嘧啶全部耐药，对两性霉素B（97.0%）、卡泊芬净（75.8%）和氟康唑（63.6%）的耐药率也很高。值得注意的是，分离出的克鲁斯念珠菌对氟康唑的普遍耐药性与其已知的固有耐药特性相符。相比之下，酮康唑（ketoconazole）和伏立康唑（voriconazole）在体外表现出最高的活性。
讨论与结论
本研究通过整合分子诊断方法，提供了安纳托利亚水牛和奶牛中亚临床乳腺炎相关念珠菌物种的全面概览。研究发现，非白色念珠菌（NAC）物种在两种宿主中均占主导地位，这与许多现代研究观察到的趋势一致，改变了以往认为白色念珠菌是主要酵母病原体的传统观念。研究特别强调了物种水平精确鉴定的必要性，因为不同物种在毒力特征和抗真菌药敏谱上可能存在显著差异。研究开发的属特异性ITS引物成功解决了通用引物对某些菌株扩增失败的问题，凸显了针对特定菌群优化分子工具的价值。
研究首次在土耳其的水牛乳腺炎分离株中检测到SAP1毒力基因，为理解这些菌株的致病潜力提供了分子依据。广泛存在的抗真菌药物耐药现象，尤其是对多种常用药物（如氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B）的高耐药率，为临床治疗敲响了警钟，强调了基于药敏试验指导用药的重要性。
总而言之，这项研究为理解该地区水牛和奶牛真菌性乳腺炎的流行病学、病原谱和抗药性模式提供了重要的基线数据。研究结果强调了将真菌病原体纳入常规乳腺炎监测、采用分子方法进行精确物种鉴定，以及依据药敏结果制定抗真菌治疗策略的重要性。这些发现不仅有助于改进畜群健康管理，提高病因学诊断的准确性，也对在“同一健康”框架下理解兽医公共卫生问题具有潜在意义。
