《Odontology》：The effect of individual sulfasalazine administration and in combination with esomeprazole on buccal mucosa of albino rats: histological, immunohistochemical, and molecular study
编辑推荐：
本研究旨在探究柳氮磺吡啶(SFZN)对口腔组织的潜在损伤影响，及其与质子泵抑制剂埃索美拉唑(ESOm)联合使用的效应。研究人员通过组织形态计量、铁沉积分析、Nrf2免疫反应性及GSH水平检测，结合彗星试验评估DNA损伤，首次系统揭示了SFZN可诱导大鼠颊黏膜发生铁死亡相关改变，包括角质层增厚、GSH耗竭、Nrf2通路破坏及DNA单链损伤，而ESOm联用能部分改善组织学异常但加剧铁沉积。该研究为理解SFZN的局部毒副作用及联合用药的复杂影响提供了重要实验依据，具有潜在的临床警示意义。
在自身免疫性疾病如溃疡性结肠炎、类风湿关节炎的治疗中，柳氮磺吡啶(Sulfasalazine, SFZN)是一种广泛应用的传统药物。然而，这把“老枪”在攻击疾病的同时，也可能带来意想不到的“流弹”伤害。已有研究表明，SFZN在人体和动物模型中可能导致肾脏损伤，其机制与诱导一种新型的程序性细胞死亡——铁死亡(Ferroptosis)有关。铁死亡的核心是铁依赖的脂质过氧化导致的细胞膜损伤，而SFZN作为Erastin的衍生物，能够抑制胱氨酸/谷氨酸逆向转运体(System xc-)，进而消耗细胞内重要的抗氧化剂谷胱甘肽(Glutathione, GSH)，并抑制谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的活性。与此同时，另一种常见药物埃索美拉唑(Esomeprazole, ESOm)，作为质子泵抑制剂，广泛用于治疗胃食管反流等疾病，既往研究提示其对肝脏损伤有保护作用，且与SFZN联用在某些肿瘤模型中显示出协同治疗效果。那么，一个关键而又被忽视的问题浮出水面：当患者因共病需要同时使用这两种药物时，它们对口腔这一直接接触药物的“前沿阵地”——颊黏膜，会产生怎样的影响？是叠加的损伤，还是如某些研究暗示的协同保护？目前，关于SFZN单独或与ESOm联合使用对口腔及口腔周围组织影响的研究寥寥无几。鉴于颊黏膜血供丰富、愈合迅速且处于菌群复杂的环境，其健康状况直接影响患者的生活质量与用药安全。因此，深入探究这两种药物对颊黏膜的效应，不仅具有重要的毒理学价值，也对临床安全用药具有直接的指导意义。为此，研究人员开展了一项针对大鼠的实验研究，相关成果发表在《Odontology》期刊上。
为了回答上述问题，研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：首先，建立了27只雄性白化大鼠的动物模型，分为对照组、SFZN给药组(600 mg/kg/天)以及SFZN联合ESOm给药组(SFZN 600 mg/kg/天 + ESOm 30 mg/kg/天)，连续灌胃给药14天。实验结束后，取大鼠颊黏膜组织进行多维度分析。在组织形态学层面，采用苏木精-伊红(H&E)染色评估上皮和角质层形态，并利用计算机图像分析系统进行角质厚度的形态计量学测量。在生化与分子层面，使用马洛里普鲁士蓝特殊染色(Mallory Prussian blue)标记并量化组织中的铁沉积面积百分比；通过免疫组织化学染色检测核因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)的蛋白表达与定位；采用比色法测定颊黏膜组织中的谷胱甘肽(GSH)水平。在遗传物质损伤评估层面，采用碱性单细胞凝胶电泳实验(Comet Assay，即彗星试验)检测DNA单链断裂情况，分析指标包括尾长(Tail length)、尾矩(Tail moment)和尾部DNA百分比(%DNA in tail)。所有数据均通过适当的统计学方法(如单因素方差分析、Kruskal-Wallis检验等)进行处理，以p值小于0.05为具有统计学显著性差异。
H&E结果（SFZN组上皮形成缺陷且角质层增厚）
组织学检查显示，对照组颊黏膜结构正常。而SFZN单独给药组表现出明显的病理改变：上皮层显著增厚，基底细胞变圆，颗粒层过早角化并占据了上皮近一半厚度，角质层不规则增厚，基底膜不规则，固有层胶原纤维分离，并可见空泡化细胞及核固缩、多形性核。相比之下，SFZN联合ESOm给药组的组织学表现得到显著改善，其上皮厚度、基底膜和上皮钉突形态均与对照组相近，颗粒层也局限于上皮表层，仅残留部分基底细胞变圆和轻微的空泡化。形态计量学分析证实，SFZN组的角质层厚度显著高于对照组和联合用药组，而后两组之间无显著差异。
马洛里普鲁士蓝特殊染色结果（SFZN组和ESOm组组织铁沉积增加）
对照组仅显示颊黏膜上皮和固有层有轻微的铁沉积。SFZN组表现出中度的铁沉积。出乎意料的是，SFZN联合ESOm给药组的铁沉积最为强烈，显著高于SFZN组和对照组。统计分析表明，联合用药组的铁沉积面积百分比最高，SFZN组次之，对照组最低，且三组间均存在显著差异。
免疫组化结果（SFZN组和ESOm组Nrf2下调）
对照组对Nrf2呈强阳性免疫反应。SFZN组的Nrf2免疫反应性仅为轻度。联合用药组的Nrf2表达为中度，虽高于SFZN组，但仍显著低于对照组。这表明SFZN单独使用严重破坏了Nrf2信号机制，而联合使用ESOm部分恢复了Nrf2的表达水平。
谷胱甘肽（GSH）组织水平耗竭
组织GSH水平检测显示，对照组的GSH含量最高，联合用药组次之，SFZN组最低。三组间的差异均具有统计学显著性。这表明SFZN能显著耗竭颊黏膜组织的GSH，而联合使用ESOm能在一定程度上缓解这种耗竭。
彗星试验DNA降解分析结果（SFZN组和ESOm组存在DNA单链损伤）
通过碱性彗星试验评估DNA损伤发现，在尾长和尾矩两个关键参数上，联合用药组和SFZN组均显著高于对照组，但这两个给药组之间无显著差异。在尾部DNA百分比参数上，三组间无显著差异。该结果表明，SFZN单独或联合ESOm使用，均能导致颊黏膜细胞发生显著的DNA单链损伤。
本研究结论与讨论部分深刻阐释了上述发现的意义。研究首次系统揭示，SFZN单独使用可在大鼠颊黏膜诱导出铁死亡的多个特征性改变：包括组织铁沉积、抗氧化标志物GSH耗竭、关键调控因子Nrf2信号通路受损，以及在细胞核水平造成DNA单链损伤。在组织学层面，SFZN导致了类似上皮发育不良的表现，如角质层异常增厚和上皮结构缺陷，这为解释使用该药物患者可能出现的口腔副作用提供了形态学基础。尤为重要的是，研究发现埃索美拉唑(ESOm)与SFZN联用呈现出复杂的“双刃剑”效应：一方面，ESOm能显著改善SFZN引起的组织学异常，部分恢复Nrf2表达和GSH水平，显示出一定的组织保护作用；但另一方面，它却戏剧性地加剧了组织中的铁沉积，其机制有待进一步阐明。这种铁沉积的加剧是否意味着某种潜在风险，是未来研究需要关注的重点。此外，研究还通过彗星试验证实了两种用药方案均可引起DNA单链损伤，这提示了药物在遗传物质层面的潜在危害，其长期影响及细胞自身的修复机制如何，仍需后续探索。
综上所述，这项研究具有重要的开创性和警示意义。它不仅首次详细描述了SFZN及其与ESOm联用对口腔颊黏膜的多层次影响，将药物副作用研究与前沿的铁死亡机制联系起来，为理解药物性口腔黏膜病变提供了新的理论视角。更重要的是，研究结果对临床实践具有直接启示：医生在处方SFZN，尤其是考虑将其与质子泵抑制剂联用时，应充分意识到其对口腔组织的潜在影响，并考虑对患者进行相应的口腔监测与健康指导。该研究也为后续更深入的机制探索指明了方向，例如深入研究Nrf2/KEAP1信号通路在其中的具体作用、不同药物浓度与疗程的影响，以及DNA损伤的修复命运等，从而为优化用药方案、保障患者用药安全提供更坚实的科学依据。
