《ACS Photonics》：Single-Molecule Peptide Discrimination via Flow-Through SERS and Machine Learning
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为解决临床样本中结构高度相似多肽的快速、准确、无标记检测难题，研究人员开发了一种结合可渗透等离激元纳米孔、微秒级SPAD单光子检测技术与机器学习分类模型的流动式SERS策略。该研究以仅有两个氨基酸差异的催产素和加压素为模型，实现了单分子水平70.5%的鉴别准确率，对40个事件平均后准确率高达99%。该技术为生物医学复杂环境下的单分子识别提供了新途径。
在生命科学和临床诊断领域，多肽（peptides）作为关键的生物分子和治疗剂，其精准鉴别一直是一项艰巨的挑战。尤其在临床复杂样本中，不同多肽的光谱信号常常相互叠加，难以区分。表面增强拉曼光谱（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy, SERS）技术凭借其独特的分子指纹特异性，被认为有望解决这一难题。然而，传统SERS技术在实际应用中却屡屡受挫，其光谱信号存在显著的波动性和变异性问题，这主要源于分子在SERS基底上的非均匀吸附和随机运动。这种不稳定性使得基于参考光谱库的鉴别方法在严苛条件下变得不可靠，极大地限制了SERS技术在临床诊断中的实际应用。为了克服这些局限性，研究人员将目光投向了创新的“流动式”检测策略。
该研究创新性地结合了可渗透的等离激元纳米孔、微秒级时间分辨的单光子雪崩二极管（Single-Photon Avalanche Diode, SPAD）相机以及机器学习算法，旨在实现对单个多肽分子的高速、高精度鉴别。研究团队选择结构极为相似、仅有两个氨基酸不同的肽类激素——催产素（Oxytocin, OT）和加压素（Vasopressin, VP）作为严格的测试模型，以验证方法的鉴别能力。
关键技术方法
研究人员首先制备了一种在多孔琼脂糖凝胶上溅射纳米结构银层形成的可渗透等离激元膜，其银晶粒间的缝隙构成了天然的纳米孔和热点（hotspot）。在施加电泳场驱动下，多肽分子可逐个穿过这些纳米孔。利用集成在拉曼显微镜中的SPAD相机，以100 μs的时间分辨率捕捉分子穿过热点时产生的SERS信号，确保了单分子检测条件。获取的海量单分子光谱数据经过预处理（包括去噪、基线校正和事件识别）后，采用主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）进行降维，并最终使用随机森林（Random Forest）分类算法对OT和VP的单分子光谱进行模式识别与分类。
研究结果
系统描述与性能
扫描电子显微镜图像显示，银膜上形成了由晶粒间隙构成的纳米孔。在100 μs的采集时间窗口下，可以清晰追踪到分子易位的动态过程，每个易位事件平均可检测到约120个拉曼光子。这些条件确保了信号源自自由穿过的单分子，而非表面吸附的分子。
分子表征
OT和VP的平均SERS光谱显示出高度相似性，但也存在可区分的差异。对单分子光谱进行PCA分析发现，两类多肽的数据点集群存在大量重叠，但其质心可分离，表明在单分子水平存在显著的光谱涨落。这直接反映了单分子鉴别的内在挑战。
机器学习辅助分类
研究人员构建了包含约400个OT和400个VP单分子光谱的数据集。经过预处理和PCA降维后，以前10个主成分作为特征输入随机森林分类器。在70/30的训练-测试集划分下，经过10次迭代，模型在区分OT和VP单分子光谱上达到了70.5%的平均准确率。值得注意的是，当累积并平均40个事件的信号后，分子鉴别的准确率可提升至99%。这表明通过适当平均，可以有效克服单次测量的噪声和波动。
混合样品分析
为了验证方法在复杂混合物中的适用性，研究人员制备了OT和VP浓度比为1:1和1:9的混合样品。将混合样品的光谱数据与纯样品数据一同输入已训练的分类模型，模型会将混合样品的事件错误分类（假阳性，False Positives）到OT和VP类别中。关键发现是，这些错误分类事件在OT和VP两类中的分布比例，与混合样品中分子的原始浓度比高度一致。对于1:1的混合样，错误分类比例约为1:1；对于1:9的混合样，测得的比例约为1:8.8。这一结果表明，该方法不仅能鉴别分子类别，还能通过分类结果的统计分布来反推混合物中各组分的相对丰度。
结论与讨论
本研究成功展示了一种基于流动式SERS结合机器学习的技术，用于高相似性单分子多肽的检测与分类。该方法利用琼脂糖支撑的纳米结构银膜，在电泳驱动下实现分子的逐个易位和检测，结合SPAD相机的微秒级探测能力，捕获了单个易位事件的SERS光谱。尽管OT和VP结构高度相似，机器学习模型仍能在单分子水平实现70.5%的鉴别准确率，对40个事件平均后准确率超过99%。更重要的是，该方法对混合物同样有效，并能通过重复分类运行来估算浓度比。这些结果强有力地表明，流动式SERS策略能有效克服传统SERS中因光谱波动和基底变异导致的问题，为复杂介质中的单分子分析，乃至未来在DNA单点突变或蛋白质翻译后修饰检测等更精密的生物分子识别领域，开辟了一条极具前景的道路。本研究成果发表于《ACS Photonics》。
