《ACS Synthetic Biology》：Vacuum and Sonication Treatment Enable Efficient Transient Gene Expression in Various Monocot and Eudicot Plant Seedlings
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为突破瞬时基因表达效率低、物种范围窄的瓶颈，研究者开发了VAST（真空与超声协同瞬时转化）方法。通过系统优化生长条件，并结合真空浸润与超声预处理，显著提升了i拟南芥/i的转化效率，并成功拓展至番茄、i芸薹/i、i苜蓿/i、i谷子/i、柳枝稷、玉米和小麦等作物。该技术为植物功能基因组学、合成生物学及生物技术研究提供了高效、通用且损伤小的新工具。
在应对全球粮食安全、可持续发展和气候变化挑战的征程中，植物无疑扮演着核心角色。遗传工程能够快速、精准地改良作物的抗逆性、生产力及养分利用效率，还能开发用于生物制造和生物能源的非食用植物。然而，这一切的进展却被一个“卡脖子”的技术所限制：现有的植物遗传转化方法通常耗时漫长、效率低下，并且仅适用于极少数物种和品种。
在众多遗传操作手段中，瞬时基因转化因其不产生可遗传的后代，仅操控完整植株的体细胞，而成为研究基因功能、蛋白定位、蛋白-蛋白/DNA相互作用以及许多合成生物学与生物工程应用的利器。它甚至可以成为利用CRISPR/Cas9等基因编辑工具创制无转基因编辑植株的第一步。尽管如此，当前瞬时转化的“工具箱”却相当有限。原生质体转化虽可用于某些物种，但这些去除了细胞壁、失去细胞身份和组织结构的“短命”细胞，无法回答许多关键的生物学问题。另一种常见方法依赖于根癌农杆菌，但其高效应用通常局限于少数双子叶植物（如本氏烟）的叶片。对于养活全球大多数人口的单子叶植物（如水稻、玉米、小麦），高效瞬时转化更是长期面临挑战。
以往的研究者们进行了诸多尝试，例如开发了用于拟南芥幼苗的AGROBEST方法，以及扩展至多种茄科植物的Fast-TrACC方法。也有研究探索利用物理辅助手段，如超声波处理产生微创以促进农杆菌进入，或真空渗透来增强递送。然而，这些方法往往仅针对单一物种进行优化，或是在基于外植体再生的稳定转化流程中使用，尚未发展成一个可在系统发育多样的完整幼苗（尤其是单子叶植物）中实现高效、标准化瞬时基因表达的通用平台。
正是在这样的背景下，一项名为VAST（Vacuum and Sonication-Assisted Transient transformation，真空与超声协同瞬时转化）的新技术应运而生，并发表于《ACS Synthetic Biology》期刊。这项研究旨在解决瞬时基因表达效率与物种适用性之间的核心矛盾。研究人员通过系统性优化植物生长与恢复条件，并在农杆菌共培养前引入精细调控的真空和超声波预处理，成功开发了一种能显著提升转化效率、并极大扩展适用物种范围的通用型瞬时基因表达工具。
为了开展这项研究，作者团队运用了几个关键技术方法。首先，他们以模式植物拟南芥为初始体系，通过定量实时PCR（qPCR）和荧光显微镜成像，系统性地优化了包括固体/液体培养基、真空处理次数与时长、超声处理时长以及农杆菌菌株和浓度在内的多项关键参数。其次，他们采用了黄色荧光蛋白（YPET）和双荧光素酶报告基因系统（GeNL/NLuc）作为可视化与定量评估转化效率及启动子活性的工具。第三，研究拓展至包括番茄、芸薹、苜蓿、谷子、柳枝稷、小麦和玉米在内的多种重要单、双子叶作物幼苗，并针对不同物种的生理特性对VAST流程（如超声时长、农杆菌菌株）进行了个性化优化。此外，他们还利用qPCR检测了缺氧应激基因iADH/i、氧化应激标记（DAB染色）等指标，综合评价了VAST处理对植物健康的影响。最后，通过一个硝酸盐响应基因的跨物种比较案例研究，展示了VAST在功能基因组学中的应用潜力。
研究结果
通过VAST提高拟南芥的瞬时转化效率
研究人员首先在拟南芥中系统优化VAST条件。他们发现，与在液体培养基中生长相比，在固体培养基上生长的幼苗更健康，为后续处理打下更好基础。施加真空处理能提高表达水平和均匀度，三次真空处理（Vac3x）比单次处理效果更佳。超声处理则能极大增强转化效率，使YPET表达量相比无处理组（固体MS培养基）提升17倍。结合超声与三次真空处理（Son&Vac3x）虽未在qPCR平均水平上进一步提升，但能将表达扩展至真叶，而单独超声处理仅在于叶中表达。进一步优化确定5分钟真空结合20秒超声为最佳参数，能在保证高效率的同时最小化组织损伤和应激反应（通过iPR1/i基因表达评估）。验证实验证实荧光信号来源于植物细胞而非农杆菌，且VAST同样适用于非无菌的土培拟南芥植株。
VAST效率高于既往方法且能降低细胞应激
与已有的AGROBEST和Fast-TrACC方法相比，VAST在拟南芥中实现了更强、更均匀的YPET表达。qPCR定量显示，VAST的YPET表达量平均分别是AGROBEST和Fast-TrACC的25倍和10倍。即使在使用另一种常用农杆菌菌株C58C1时，VAST依然显著优于其他方法。重要的是，VAST转化后的幼苗更健康。AGROBEST和Fast-TrACC处理的幼苗表现出明显的叶片损伤、高水平的缺氧应激（iADH/i基因表达上调超90倍）和氧化应激（DAB染色加深），而VAST处理组的应激水平与模拟处理对照组相当。VAST引起的机械损伤相关茉莉酸信号（iJAZ10/i基因表达）仅是短暂轻微升高。长期观察发现，VAST转化的幼苗在10天后仍保持相对健康的生长和可检测的报告基因表达，而其他方法处理的幼苗则十分脆弱。
VAST可高效转化多种双子叶植物物种
将VAST方法拓展至番茄、芸薹和苜蓿等双子叶植物。研究人员以拟南芥的优化方案为起点，针对各物种特性调整了参数，如提高农杆菌浓度、调整超声时长等。荧光显微镜和共聚焦显微镜成像显示，在转化后4-5天，所有三种物种的子叶和真叶中均观察到强烈的YPET表达，且YPET蛋白定位于细胞核和细胞质。对共聚焦图像的定量分析显示，番茄、芸薹和苜蓿叶片细胞中报告基因的表达率平均分别为42%、38%和26%。
VAST可高效转化多种单子叶植物物种
研究进一步将VAST优化用于谷子、柳枝稷、小麦和玉米等重要单子叶植物。初始的eudicot方案对单子叶植物效果不佳，因此进行了多轮优化，包括改用农杆菌AGL1菌株、提高菌液浓度、延长超声时间至30秒并增加真空处理至4轮。优化后，在4-6天后于所有四种单子叶植物的叶片中均观察到了报告基因表达。其中谷子表达最强最均匀，柳枝稷和玉米表达较强但较零散，小麦的转化效率相对较低。共聚焦成像确认了报告蛋白在细胞质和细胞核中的定位。定量显示，玉米、谷子、柳枝稷和小麦叶片细胞的平均表达率分别为36%、23%、21%和9%。与EHA105菌株相比，AGL1菌株在谷子中能产生更强表达且组织损伤更小。
通过VAST瞬时转化对植物硝酸盐响应的功能分析
为展示VAST的应用价值，研究进行了一个案例：比较双子叶的拟南芥和单子叶的谷子对硝酸盐的响应。他们构建了一个含有硝酸盐响应启动子（NRP）和双荧光素酶报告基因（GeNL为响应报告，NLuc为内参）的传感电路，并通过VAST将其转入幼苗。实验表明，在拟南芥中，NRP活性随硝酸盐浓度（0-10 mM）增加而增加，且对硝酸盐具有特异性，不受铵、谷氨酰胺或KCl的激活。动力学分析显示，在氮饥饿后提供硝酸盐，NRP活性持续上升数日后下降。在谷子中，NRP同样能被硝酸盐激活，但其响应和恢复至基线的速度比拟南芥更快（4天 vs 7天），提示了两个物种在氮利用效率或需求上可能存在差异。
VAST与模块化调控元件的兼容性验证
研究还测试了VAST与标准化模块化克隆元件库的兼容性。他们将四种启动子和四种终止子以矩阵形式组装成双报告基因构件，并通过VAST转化拟南芥幼苗。比率式GeNL/NLuc测量结果显示，所有启动子-终止子组合均能检测到表达，且表达水平大致符合这些调控元件已知的强度等级，表明VAST能够保持模块化转录行为的可预测性，适用于在完整幼苗中快速测试调控元件。
研究结论与讨论
本研究开发的VAST技术，通过将植物生长介质从液体改为固体，并系统性引入和优化真空渗透与超声预处理，显著提高了基因表达的效率、均匀性和可重复性。与AGROBEST和Fast-TrACC等方法相比，VAST在拟南芥中实现了高达25倍和10倍的表达提升，且不引起严重的植物应激或组织损伤，幼苗更健康，支持长达16天的研究。其核心技术优势在于共培养前对植物进行真空和超声预处理，显著增强了农杆菌对内部组织的可及性。
VAST的成功应用跨越了包括拟南芥、番茄、芸薹、苜蓿、谷子、柳枝稷、小麦和玉米在内的多种单、双子叶植物幼苗，在单细胞水平上，拟南芥和谷子幼苗的平均转化效率分别可达60%和23%。该方法克服了原生质体转化系统在细胞寿命、系统性生理反应研究方面的局限，使得在完整幼苗中进行长期、生理相关的研究成为可能，正如硝酸盐响应案例所展示的。
此外，VAST与模块化克隆部件兼容，可用于快速测试调控元件。尽管仍需针对不同物种进行优化（例如小麦的效率仍较低），但VAST作为一个通用平台，为植物功能基因组学、合成生物学和生物技术研究开辟了新途径。未来，将其与CRISPR/Cas基因组编辑、工程化超毒力农杆菌菌株等技术结合，有望进一步扩展其在作物改良和基础研究中的变革性应用潜力。总之，VAST以其高效、通用和对植物生理低影响的特性，为解决当前植物遗传转化领域的瓶颈问题提供了一个强有力的新工具。
