《Biosensors》：Molecularly Imprinted Polymers as Biomimetic Test Zones in Paper-Based Nucleic Acid Assays—Comparing Vertical and Lateral Flow Formats
Jennifer Marfà,
Anaixis del Valle,
Maria Del Pilar Taboada Sotomayor and
María Isabel Pividori
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本研究针对POCT核酸测试对稳定识别元件的需求，开发了一种特异性识别生物素（biotin）的分子印迹聚合物（MIP）作为仿生检测区，并将其集成到核酸垂直流（NAVF）和核酸横向流（NALF）两种纸基平台中，用于检测大肠杆菌的双标记PCR扩增子。结果显示，NAVF平台可实现3分钟快速检测，视觉检出限（vLOD）为0.01 ng mL-1；NALF平台总检测时间小于15分钟，视觉检出限为0.03 ng mL-1。该研究证明了生物素-MIP作为合成识别元件在快速、低成本纸基核酸检测中的潜力，其中NAVF平台侧重于速度和设计灵活性，而NALF平台则具有更高的分析灵敏度，为开发稳定、适应性强的即时诊断工具提供了新策略。
随着全球健康需求不断演变，快速、灵敏且易于获取的诊断技术在结核病、HIV和COVID-19大流行等危机中变得至关重要。即时检测（Point-of-care testing, POCT）能够在患者护理现场提供即时结果，极大减少了对中心实验室的依赖。其中，纸基诊断平台因其低成本、易用性和便携性而备受瞩目。横向流分析（Lateral Flow Assays, LFAs）是这类平台中最成熟的代表之一，例如家庭妊娠检测棒和SARS-CoV-2抗原检测试纸条。它们依靠毛细作用在膜上运输样本，通过固定的识别元件捕获目标物，产生肉眼可见的信号。然而，LFA也存在一些固有局限，比如在多通路检测或处理大样本量时能力受限，并且易受“钩状效应”（过量分析物导致信号减弱）的干扰。相比之下，垂直流分析（Vertical Flow Assays, VFAs）作为一种新兴的非传统形式，通过让样本垂直流过堆叠的膜，提供了更短的检测时间、处理更大样本量的能力以及对“钩状效应”更强的抗性等优势。
尽管LFAs和VFAs在多种诊断场景中都有用武之地，但它们都严重依赖抗体等生物识别元件。这在资源有限的环境中可能成为一个问题，因为这些生物元件通常需要冷藏保存，稳定性受限。分子印迹聚合物（Molecularly Imprinted Polymers, MIPs）作为一种合成替代方案应运而生。MIPs通过在模板分子周围聚合功能性单体，之后移除模板，留下与目标物在尺寸、形状和官能团分布上互补的特异性结合腔。与生物识别元件相比，MIPs具有更优异的化学和机械稳定性、更长的保质期，并且可以适配识别各种靶标分子，是开发可靠、经济的纸基诊断设备的理想候选材料。
这项发表在《Biosensors》期刊上的研究，正是探索了MIPs在这一领域的应用潜力。研究人员在先前工作的基础上，将一种特异性识别生物素的MIP（biotin-MIP）作为仿生捕获区，分别整合到核酸垂直流（Nucleic Acid Vertical Flow, NAVF）和核酸横向流（Nucleic Acid Lateral Flow, NALF）两种纸基平台中，专门用于检测来自大肠杆菌（Escherichia coli）的双标记（一端标记生物素BIO，另一端标记地高辛DIG）PCR扩增子。通过评估两种平台的性能，研究人员比较了它们在速度、灵敏度和设计上的优劣，旨在为开发适应不同应用需求的、稳健的即时诊断工具提供新的思路。
为了开展这项研究，作者运用了几个关键技术方法。首先是分子印迹聚合物的合成与表征，采用沉淀聚合法制备了生物素-MIP，并利用傅里叶变换红外光谱和扫描电子显微镜确认了其结构和形貌。其次，研究人员系统地优化了垂直流检测（NAVF）装置的组件，包括硝化纤维素膜、吸收垫、间隔层、双面胶带和滤纸等，以提升检测灵敏度和降低背景信号。接着，他们建立了将生物素-MIP固定在两种平台的反应区或检测线上的方法，并通过扫描电子显微镜观察了聚合物在膜内的分布情况。最后，实验的核心是检测大肠杆菌的双标记PCR扩增子，在NAVF和NALF两种平台上分别建立并执行了检测流程，通过酶促显色反应（使用辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体和TMB底物）产生可视化的蓝色信号，并利用智能手机和ImageJ软件对信号强度进行图像处理和半定量分析。所有分析均在生物安全二级实验室（BSL-2）中进行，以确保操作的安全性。
结果与讨论
3.1. 生物素特异性分子印迹聚合物的合成与表征
通过傅里叶变换红外光谱证实了聚合物网络的形成以及生物素模板的完全去除。扫描电子显微镜分析显示，生物素-MIP为平均尺寸144.3纳米的球形纳米颗粒，小于对应的非印迹聚合物。从先前的特异性结合等温线研究中，确定了生物素-MIP的解离常数和最大结合容量分别为Kd= 7.09 × 10?10mol L?1和Bmax= 304 fmol mg?1。这些数据表明，该生物素-MIP具有高亲和力，适合作为固体捕获相整合到纸基检测区。
3.2. 垂直流检测盒、横向流检测条的组装及生物素特异性分子印迹聚合物在膜中的整合
扫描电子显微镜图像清晰地显示了生物素-MIP在FF80HP硝化纤维素膜孔内的分布情况。在较低放大倍数下，可以观察到MIP浸渍区与裸露的硝化纤维素网络之间存在明显的界面。在较高放大倍数下，可以看到生物素-MIP颗粒与膜基质紧密相连，分布在其三维多孔结构中，证明MIP被成功固定，且膜的完整性得以保持，这对于保证检测过程中一致的毛细管流动至关重要。
3.3. 垂直流检测盒中分子印迹聚合物整合的优化
由于支撑层不渗透，NALF平台中优化过的带背衬硝化纤维素膜（FF80HP）不适合NAVF。因此，研究人员对NAVF平台的主要组件进行了独立优化，最终选择了无背衬的AE98硝化纤维素膜、VF2垫作为间隔层、CF4纤维素垫、CF7吸收垫、1567型号双面胶带以及薄滤纸，这些优化显著改善了背景信号、提高了灵敏度，并确保了单向流动。
3.4. 核酸垂直流检测检测双标记扩增子
该检测过程示意图清晰地展示了在NAVF平台反应区中，生物素-MIP特异性捕获扩增子上的BIO标签，随后抗DIG-HRP结合DIG标签，最后加入TMB底物产生比色信号。评估结果显示，随着扩增子浓度增加，检测线处的蓝色信号强度增强。视觉检出限为0.01 ng mL?1。通过图像处理进行非线性回归分析，计算得到该方法的检出限为2.53 × 10?2ng mL?1，定量限为2.76 × 10?2ng mL?1，证实了其检测低浓度分析物的能力。
3.5. 核酸横向流检测检测双标记扩增子
NALF检测过程同样通过示意图说明。结果表明，信号强度与分析物浓度成正比。总检测时间小于15分钟，视觉检出限为0.03 ng mL?1。定量分析获得的检出限和定量限分别为2.95 × 10?3ng mL?1和4.02 × 10?3ng mL?1，比NAVF定量结果灵敏约一个数量级。这归因于NALF的设计允许扩增子与生物素-MIP有更长的相互作用时间，从而提高了结合效率。
比较这两种平台可以发现，它们各有优势。NAVF提供了更低的视觉检出限和更快的检测速度（3分钟），适合于需要立即获得定性结果（如快速筛查）的场景。而NALF则实现了更高的分析灵敏度（定量检出限比NAVF低一个数量级），更适合需要高灵敏度、半定量检测低浓度分析物的应用。两者的成功都证明了生物素-MIP作为合成识别元件在两种纸基平台中的多功能性和优异的分析性能。
结论与讨论
本研究成功地将生物素特异性MIP作为合成识别元件整合到核酸垂直流和核酸横向流平台中，用于检测双标记PCR扩增子。尽管链霉亲和素-生物素对仍是亲和力的黄金标准，但在即时诊断设备中，性能不仅取决于亲和力，还受试剂成本、批次重复性、储存稳定性和非理想环境下的稳健性等因素影响。生物素-MIP作为一种仿生捕获元件，可规模化制备并以固体检测区形式集成，具有优异的化学和热稳定性，为对储存和制备条件更敏感的蛋白质基捕获层提供了替代方案。
研究结果表明，两种平台都表现出优异的灵敏度，其中NAVF的检出限为2.53 × 10?2ng mL?1，而NALF的检出限为2.95 × 10?3ng mL?1。这项比较性评估凸显了两种纸基形式的互补优势。NAVF允许在3分钟内实现快速定性检测，其视觉检出限低于NALF，适用于对即时目视结果要求严格的场合。相比之下，NALF的灵敏度比NAVF高一个数量级，总检测时间少于15分钟，使其更适合需要高度灵敏、半定量检测低浓度分析物的应用。因此，应根据具体诊断需求在这两种平台之间做出选择。
将MIPs成功整合到传统和非传统的纸基诊断平台中，突显了其多功能性和超出本研究范围的潜在应用前景。这些设备也为检测其他生物标志物或分析物提供了进一步定制的机会。尽管结果令人鼓舞，但仍需利用临床样本和复杂的生物基质进行进一步验证，以加强所提出方法的转化相关性。总体而言，这项工作是开发基于MIP的纸基诊断平台的重要一步，为未来可靠、稳健且经济的诊断工具的发展奠定了基础。虽然热循环的需求可能被视为POCT部署的一个限制，但便携式PCR仪器的最新进展已显著提高了在中心化实验室之外进行核酸扩增的可行性。本研究中提出的纸基MIP平台可与基于便携式PCR设备的简化分子检测工作流程兼容。
