针对出口水产品中副溶血性弧菌的酶促重组酶扩增（ERA）快速检测方法的建立与验证

《Biosensors》：Establishment and Validation of a Rapid ERA Detection Method for Vibrio parahaemolyticus in Exported Aquatic Products Ying Liang, Jiahua Wang, Yufeng Wang and Feng Xue

本研究针对现有副溶血性弧菌检测方法操作复杂、耗时久、依赖专业设备等问题，建立了基于国产ERA技术的快速、敏感、特异的荧光与比色双模式检测方法。该方法靶向tlh和irgB基因，可在20分钟内完成检测，灵敏度达10?1ng/μL，人工污染样品检出限为10 CFU/25 g，并经过多实验室协同验证，为水产品安全现场快筛提供了可靠的技术方案。

　　

享受美味海鲜是现代生活中的一大乐事，然而，美味背后也可能隐藏着“刺客”——副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）。这种嗜盐性的革兰氏阴性菌是导致沿海地区食源性疾病的主要病原体之一，食用受污染的水产品后可能引发急性腹泻、腹痛等症状，严重时甚至危及生命。随着国际贸易的蓬勃发展，如何在海产品到达消费者餐桌前，快速、准确地“揪出”这些看不见的威胁，是全球食品安全监管面临的共同挑战。

传统的检测手段，如微生物培养法，虽然“金标准”可靠，但动辄需要24到72小时的培养和鉴定周期，宛如一场“马拉松”，难以满足港口快速通关和企业现场质控的迫切需求。分子生物学方法如实时荧光PCR，虽然速度有所提升，但仍需依赖精密的PCR仪和复杂的温度循环，在资源有限的基层或野外现场往往“水土不服”。因此，开发一种如同“现场快检试纸”般便捷、快速、精准且不依赖大型设备的检测技术，已成为业界亟待攻克的难题。

为了破解这一难题，研究人员将目光投向了酶促重组酶扩增（Enzymatic Recombinase Amplification, ERA）技术。这是一种由中国在2019年自主研发的新型等温核酸扩增技术，它能在恒温（37-39°C）下快速完成目标基因的指数级扩增，无需复杂的热循环设备，为现场快速检测（Point-of-Care Testing, POCT）带来了曙光。那么，能否将这项前沿技术成功应用于水产品中副溶血性弧菌的检测，并建立起一套经得起严格验证的标准化方法呢？

发表在《Biosensors》上的一项研究给出了肯定的答案。由Ying Liang, Jiahua Wang, Yufeng Wang和Feng Xue合作完成的研究，成功建立并验证了一套基于ERA技术的副溶血性弧菌快速检测方法。该研究设计并筛选了靶向副溶血性弧菌种特异性基因——不耐热溶血素基因（thermolabile hemolysin gene, tlh）和毒力相关基因——铁调控毒力调节蛋白基因（iron-regulated virulence regulatory protein gene, irgB）的特异性引物和探针，并开发了荧光和比色两种检测模式。验证结果显示，该方法特异性好、灵敏度高、操作简单快捷，整个检测过程（含样品制备）仅需约20分钟，为出口水产品中副溶血性弧菌的快速筛查与风险监控提供了一套可靠、实用的技术解决方案。

为了开展这项研究，作者运用了几个关键的技术方法。首先，是靶向基因引物/探针设计与筛选：针对tlh和irgB基因的保守区域，手动设计并筛选了多组高特异性的ERA引物和探针。其次，是双模式ERA检测体系的建立：分别优化了荧光ERA（使用FAM标记探针，在便携式qPCR仪上监测实时信号）和比色ERA（反应后加入SYBR Green I染料，肉眼观察颜色变化）的反应体系与程序。第三，是严格的方法学验证**：依据中国国家标准GB 4789.45-2023，对方法的包容性（使用30株副溶血性弧菌）、排他性（使用30株其他常见食源性病原菌）、灵敏度（通过纯DNA梯度稀释和人工污染样品确定检出限）以及稳健性（通过五个海关技术中心的协同研究验证）进行了系统评估。研究所用的60株实验菌株来源于ATCC、DSM、CMCC等权威保藏中心，确保了实验材料的可靠性与代表性。

3.1. 检测过程与结果分析

研究建立的快速检测流程始于水产品样品的匀浆和煮沸法快速DNA提取。随后，在37–39°C恒温条件下，使用靶向tlh和irgB基因的引物和探针进行20分钟的ERA等温扩增。结果可通过双模式判读：荧光模式下，便携式仪器实时监测的“S”形FAM信号曲线指示阳性；比色模式下，扩增后加入SYBR Green I染料，肉眼可见的绿色荧光指示阳性。

3.2. 荧光引物与探针的筛选

以副溶血性弧菌ATCC 17802为模板，比较了两组引物探针组合（VP-1F/1R/1P和VP-3F/3R/3P）的扩增效率。结果显示，靶向irgB基因的VP-1F/1R/1P组合比靶向tlh基因的VP-3F/3R/3P组合具有更高的荧光值和更早的循环阈值（Ct），表明其扩增效率更高，因此被选用于后续荧光方法的建立。

3.3. 荧光方法的特异性与包容性分析

进一步分析显示，VP-1F/1R/1P组合成功扩增了全部30株副溶血性弧菌，而对另外30株其他常见食源性病原菌（包括溶藻弧菌、单核细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌等）均无交叉反应，显示出极高的特异性。

3.4. 比色法引物的筛选

使用三株副溶血性弧菌为模板，筛选了VP-1F/1R、VP-2F/2R和VP-3F/3R三组引物。结果显示，所有引物组均能检出目标菌，但靶向tlh基因的VP-2F/2R组显示出最亮的绿色荧光和最短的阳性时间，扩增效率最高，因此被选用于比色方法。

3.5. 比色方法的特异性与包容性测试

对VP-2F/2R引物组进行特异性分析。电泳和比色结果均表明，该引物组仅对30株副溶血性弧菌产生扩增条带和绿色荧光反应，而对其他非目标菌无反应，证明其具有良好的特异性。

3.6. 实际样品的灵敏度测试

依据GB 4789.45-2023，选择扇贝（双壳类）、鳕鱼（鱼类）和对虾（甲壳类）三种基质进行灵敏度验证。通过计算LOD₅₀（50%检出水平的微生物数）和RLOD（相对检出限），确认ERA荧光法、比色法与参考培养法的检测结果一致。该方法的灵敏度（LOD₅₀）达到0.35~0.53 CFU，在三种水产品基质中的最低稳定检出限为10 CFU/25 g。

3.7. 人工污染样品的检测

对鱼、虾、贝类样品进行不同水平（10³, 10², 10¹, 10⁰CFU/25 g）的人工污染。检测结果显示，该方法能稳定检出三种水产品中污染水平为10 CFU/25 g的样品，检出率为100%，表明其在真实食品基质中的最低检出限为10 CFU/25 g。

3.8. 市售样品的测试

对29份市售水产品进行检测，仅一份贝类样品检出副溶血性弧菌，检出率为3.45%。ERA比色法、荧光法的检测结果与国家标准GB 4789.7-2013（副溶血性弧菌检验）的结果完全一致，证实了所建立方法的准确性。

3.9. 协同验证结果

国内五个海关技术中心按照统一方案进行验证。结果显示，在包容性、排他性、灵敏度及人工污染样品检测结果上具有高度一致性（Kappa系数 = 0.98），进一步证实了方法的稳定性和可靠性。整个检测过程仅需20分钟，且无需大型精密仪器。

研究结论与意义

本研究成功建立并系统验证了一套基于国产ERA技术的副溶血性弧菌快速双模式检测方法。该方法的核心优势在于：快速，全过程仅需约20分钟，远超传统培养法（24-72小时）甚至常规PCR；灵敏特异，对纯DNA灵敏度达10^?1ng/μL，对人工污染样品检出限达10 CFU/25 g，且与30种非目标菌无交叉反应；便捷易用，在恒温（37-39°C）下完成，无需热循环仪，结合便携式等温扩增设备和比色法肉眼判读，尤其适合资源有限或现场环境使用；可靠可推广，经过多实验室协同验证，重现性优秀，并已证明与国家标准方法等效。

该研究不仅为出口水产品中副溶血性弧菌的快速筛查与风险监控提供了一个强有力的技术工具，也展示了国产ERA技术在食源性病原体现场快速检测领域的巨大应用潜力。与环介导等温扩增（LAMP）等技术相比，ERA的引物设计更简单（仅需一对引物和一个探针），降低了非特异性扩增风险，增强了特异性。研究的讨论部分也指出了未来的优化方向，如扩展更多水产品基质的验证、简化样品前处理步骤，以及探索与CRISPR/Cas技术联用以进一步提升检测性能。这项工作为提升我国乃至全球水产品安全控制水平，防范食源性疾病风险，提供了一项创新且实用的技术方案。