基于表面等离子体共振的细胞外囊泡CXCR4检测：一种新兴癌症诊断工具的潜力验证

《Biosensors》：Surface Plasmon Resonance as a Potential Diagnostic Tool for the Detection of CXC Chemokine Receptor 4 (CXCR4) on Extracellular Vesicles Kaat Verleye, Sam Noppen, Arnaud Boonen, Yagmur Yildizhan, Tom Van Loy, Cindy Heens, Frank Vanderhoydonc, Cláudio Pinheiro, Paula M. Pincela Lins and Dominique Schols + 6 authors

本文针对细胞外囊泡（EVs）表面生物标志物检测标准匮乏、特别是CXCR4诊断潜力未充分挖掘的问题，研究人员利用表面等离子体共振（SPR）BiacoreTM技术，建立了一种无标记、实时的标准化方法，成功检测并分子谱型了不同癌细胞系来源EVs上的CXCR4，其表达水平与亲本细胞高度相关，展现了SPR技术及EVs-CXCR4在疾病诊断，尤其是CXCR4异常表达相关癌症中的巨大应用潜力。

　　

在生命科学的微观世界里，细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）正扮演着越来越重要的角色。这些由细胞分泌的纳米级“包裹”，携带着来源细胞的“身份信息”和“功能指令”，在细胞间通讯、疾病发生发展等过程中起着关键作用，被认为是极具潜力的疾病生物标志物和新药递送载体。其中，一种名为CXC趋化因子受体4（CXCR4）的蛋白质备受关注。CXCR4是一种G蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptor, GPCR），在超过23种癌症、神经退行性疾病、自身免疫病等多种疾病中异常表达，是重要的药物靶点。研究发现，CXCR4也会出现在EVs的表面，并且与癌症进展、转移乃至HIV病毒入侵密切相关。然而，尽管潜力巨大，EVs表面的CXCR4作为诊断标志物仍未被充分探索和应用。一个主要瓶颈在于，缺乏一种高效、标准化的方法来精确检测和表征EVs表面这种复杂的膜蛋白。

传统的EVs检测技术，如酶联免疫吸附测定（ELISA）、蛋白质印迹（Western blot）和流式细胞术（Flow Cytometry, FCM），往往存在灵敏度不足、需要标记、或难以实时分析等局限。面对这一挑战，来自KU Leuven等机构的研究团队将目光投向了表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）技术。SPR是一种无需标记、可实时监测分子间相互作用的生物传感技术，对靠近传感器表面150纳米范围内的结合事件极为敏感，非常适合检测EVs这类纳米颗粒。该团队发表在《Biosensors》上的研究，旨在评估SPR技术，特别是商业化的Biacore^TM系统，在检测EVs表面CXCR4方面的诊断潜力，并探索其作为癌症诊断新工具的可行性。

为了系统性地开展这项研究，研究人员运用了多项关键技术。他们首先使用重组EVs（recombinant EVs, rEVs）作为标准品，在Biacore^TMT200系统上建立并优化了无标记的EVs捕获生物检测方法，评估了其检测限、特异性和重复性。通过流式细胞术筛选了七种CXCR4表达水平不同的癌细胞系。利用优化后的尺寸排阻色谱法（Size Exclusion Chromatography, SEC）从这些细胞系的条件培养基中分离出EVs，并通过纳米颗粒追踪分析和透射电子显微镜对分离的EVs进行表征和验证。最后，使用单粒子干涉反射成像传感器对SPR的部分结果进行了基准测试和单囊泡水平的共定位验证。

3.1. 利用rEVs建立标准化的SPR无标记EVs检测生物测定法

研究人员开发了一种稳健的免疫测定法。他们在C1传感器芯片上固定兔抗小鼠抗体，然后捕获不同的EVs标志物小鼠单抗（抗CD9、抗CD63、抗CD81）和抗CXCR4抗体（12G5克隆），最后注入EVs样本。通过这种方法，他们利用rEVs评估了该生物传感器的性能。结果显示，针对不同抗体的检测限在1.56×10⁸至2.03×10⁸颗粒/毫升之间，远低于人体血浆中EVs的典型生理浓度。传感器芯片可稳定重复使用至少100次，且不同日期测量的精密度良好。重要的是，rEVs上也被检测到了CXCR4，而同型对照抗体未显示任何结合，证明了检测的特异性。

3.2. 利用rEVs优化EVs分离方案

为了提高EVs分离的得率和可靠性，研究团队以rEVs为参照，优化了基于尺寸排阻色谱的分离流程。他们发现，在缓冲液中添加牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）能将rEVs的回收率从约12%显著提升至近100%。透射电子显微镜图像证实了分离颗粒具有典型的杯状囊泡形态。优化后的方案确定，SEC的第4和第5组分含有最高浓度的EVs，为后续研究提供了高质量的EVs样本。

3.3. 所选细胞系的CXCR4表达的流式细胞术分析

在分离EVs之前，研究人员先通过流式细胞术测量了七种细胞系表面的CXCR4表达水平。结果显示，不同细胞系的表达差异显著：MOLT-4和MT-4细胞内源性高表达；转染了CXCR4的HEK293.CXCR4和U87.CXCR4细胞也呈现高表达；而未转染的HEK293和MCF-7细胞表达水平较低，U87细胞则几乎不表达。这为后续关联细胞与EVs的CXCR4水平奠定了基础。

3.4. 利用SPR生物测定法无标记检测不同细胞系来源的EVs

利用建立的SPR方法，研究人员检测了从七种细胞系分离的EVs（SEC第5组分）。他们分析了三种经典的四跨膜蛋白（CD9, CD63, CD81）以及CXCR4，得到了每种EVs独特的SPR分子指纹图谱。结果表明，不同细胞来源的EVs，其四跨膜蛋白的表达谱存在显著差异，并非所有EVs都均匀高表达这些“通用”标志物。更重要的是，CXCR4在所有被测EVs上均有检出，且其表达水平在不同细胞系间差异明显，特别是在高表达细胞系（如MOLT-4, MT-4, HEK293.CXCR4）来源的EVs上信号更强。最关键的相关性分析显示，EVs上的CXCR4 SPR信号与亲本细胞膜上的CXCR4表达水平（由流式细胞术测得）存在强正相关（r = 0.7960），表明CXCR4从细胞膜向EVs膜发生了主动转移。

3.5. 使用SP-IRIS技术对HEK293和HEK293.CXCR4细胞来源的EVs进行共定位分析

为了在单颗粒水平验证SPR结果，研究使用了单粒子干涉反射成像传感器。该技术通过将EVs捕获在固定有抗CD9、CD63或CD81抗体的芯片上，再用荧光标记的抗CXCR4抗体进行检测，实现了CXCR4与四跨膜蛋白的共定位可视化。结果显示，无论是纯化后的EVs样本还是未经纯化的细胞培养上清，都能检测到来自HEK293.CXCR4细胞的CXCR4阳性EVs，而来自普通HEK293细胞的CXCR4阳性EVs则主要在纯化后的富集样本中才能被明显检测到。这证明了SPR检测到的信号确实来源于同时携带CXCR4和四跨膜蛋白的单个EVs。

3.6. 使用SPR生物传感器直接在粗混合物中检测EVs

最后，研究测试了SPR在复杂样本中的检测能力。他们将HEK293和HEK293.CXCR4细胞来源的EVs掺入含有10% EV去除血清的细胞培养基中，模拟“粗混合物”样本。SPR分析成功检测并区分了这两种EVs，其标志物表达谱（CD81为主，CXCR4在HEK293.CXCR4来源EVs中高表达）与在缓冲液中得到的结果一致。这证明了所开发的SPR生物传感器具备在接近实际样本的复杂基质中直接、特异性检测和分子分型EVs的潜力。

本研究成功开发了一种基于SPR Biacore^TM技术的快速、灵敏、无标记的EVs检测与分子分型平台。利用rEVs作为标准品，研究团队不仅优化了EVs分离流程，还建立了一套标准化、可重复的检测方法，其检测限足以应对生理浓度的EVs样本。核心发现在于，CXCR4普遍存在于不同癌细胞系来源的EVs表面，且其表达水平与亲本细胞膜上的表达高度相关，这为利用EVs-CXCR4作为反映肿瘤状态的“液体活检”标志物提供了直接证据。研究创造性地提出了“SPR分子指纹”的概念，揭示了不同来源EVs表面标志物表达的异质性，提示了依赖单一“通用”标志物进行EVs捕获或检测可能存在的漏检风险。

在讨论中，作者强调了该技术的多重优势：高灵敏度、宽动态范围、对小尺寸颗粒的检测能力、低样本消耗、芯片可重复使用以及自动化潜力。更重要的是，研究证实了该技术能够直接在添加了血清的复杂培养基中检测EVs，这为未来将其应用于更复杂的临床样本（如血浆）铺平了道路，有望减少样本前处理带来的变异性。尽管在比较针对不同靶点的抗体信号强度时需谨慎，但该平台在快速筛选和比较不同EVs样本的特定标志物表达方面展现出巨大价值。

综上所述，这项研究不仅揭示了EVs相关CXCR4作为诊断标志物的巨大潜力，更重要的是，它验证了SPR Biacore^TM技术作为一种强大工具，在EVs相关基础研究和转化医学应用中的可行性。它为开发针对CXCR4异常表达疾病的新型诊断方法开辟了新途径，并为利用SPR进行EVs表面蛋白质组学研究和药物发现奠定了坚实的方法学基础。