《Biosensors》：Non-Invasive Urine-Based Diagnostic Technologies for Early Bladder Cancer
Zhe Hao,
Shuhua Yue,
Lin Yao,
Yanqing Gong,
Jian Yu and
Liqun Zhou
编辑推荐：
本综述系统评述了膀胱癌（BCa）无创尿液诊断新策略。聚焦五大方向：人工智能（AI）增强尿液细胞学、基因组（如PCR/NGS）与表观遗传（如DNA甲基化）检测、转录组（mRNA/miRNA/lncRNA）分析和蛋白/肽/代谢物（如SERS、纳米酶）检测。分析了各项技术的诊断效能、创新性及临床转化潜力，并指出了标准化不足、成本高昂等现存挑战，展望了多组学与AI整合、即时检测（POC）设备及大型前瞻性试验等未来方向，以推动BCa管理向分子早期检测、精准个性化诊疗转变。
2. AI 赋能尿液细胞学检测
传统尿液细胞学是膀胱癌诊断的重要无创工具，但其灵敏度（尤其对早期低级别肿瘤）受限，且存在主观性强、重复性差等问题。人工智能（AI）技术的引入为尿液细胞学检测带来了新突破。AI系统通过高效分析尿液细胞学图像，自动进行细胞水平分类和患者水平诊断，提升了诊断的准确性、一致性和效率。
在单细胞水平分类方面，深度学习模型，特别是卷积神经网络（CNN），已得到成功应用。与参数密集、易过拟合的人工神经网络（ANN）相比，CNN通过局部感受野、参数共享和池化操作，优化了架构，保留了图像的空间特征。研究显示，基于CNN的模型在诊断高级别膀胱癌时，曲线下面积（AUC）可达0.88。通过细粒度CNN模型、多尺度特征融合策略（如消除背景噪声干扰）以及结合细胞核质比、核面积、染色质非典型性等形态特征，可进一步提升尿液中肿瘤细胞的识别精度，灵敏度可达0.896–1.000。专门的细胞分割工具（如“CircleCut”）结合数据增强技术，使细胞分类的准确率可达95%。这些进展为开发基于AI的尿液细胞学诊断平台奠定了基础。
在患者水平诊断方面，基于CNN的深度学习系统可有效预测尿液细胞病理图像中恶性组织的存在，其预测结果可基于模型选出的异常细胞进行解释。全自动AI病理预测系统在数字化尿液细胞学涂片测试中，其灵敏度（63%）显著高于细胞病理学家（46%），且特异性相当。目前，已有商业化的膀胱癌AI检测平台问世。例如，VisioCyt平台在前瞻性多中心研究中，总体灵敏度达84.9%，对低级别肿瘤的灵敏度（77%）更是大幅超过传统尿液细胞学（26.3%）。另一平台AIxURO整合了巴黎报告系统（TPS 2.0）的形态学诊断标准，通过对比学习框架和多尺度特征融合机制，实现了对尿路上皮细胞的高通量数字分析，辅助诊断的灵敏度达92.3%，特异性达100%。该平台还能识别术后随访中的早期复发，提升了尿液细胞学报告的可信度。
总而言之，AI技术通过自动化的细胞分割、精确分类和定量形态学分析，显著提升了尿液细胞学对早期、低级别膀胱癌的检测性能，使其有望转变为一种高灵敏度的无创筛查和监测工具。
3. 尿液基因组检测技术
膀胱癌患者的尿液样本中含有大量肿瘤来源的DNA/RNA，可作为液体活检标志物用于诊断和监测。相关检测技术的发展主要集中在“提高小肿瘤检出率”和“突破早期漏诊瓶颈”上。
3.1. 尿液DNA检测技术
聚合酶链式反应（PCR）技术是早期筛查的首选，因其快速、成本低。基于两基因比值模型（如IQGAP3/BMP4）的研究，为早期诊断奠定了基础，该模型诊断早期低级别膀胱癌的AUC为0.862。通过整合TERT启动子突变、FGFR3突变等，发展出了多基因尿液检测。例如，Uromonitor?检测将OTX1基因突变替换为KRAS基因突变，对膀胱癌复发的总体灵敏度达100%（样本量需考虑），对低级别肿瘤的灵敏度（65%）显著高于尿液细胞学（0%）。其阴性预测值（NPV）高达98.8%，支持安全地减少约30%的膀胱镜检查频率。
下一代测序（NGS）技术通过多维分子特征突破了小肿瘤检测的瓶颈。包括全基因组测序（WGS）和深度测序技术。基于WGS技术开发的UroSEEK检测方案，对低级别膀胱癌的灵敏度达67%，远超过尿液细胞学（0%），并能检出仅含1-2个基因突变的早期肿瘤。为降低成本，浅层全基因组测序（sWGS）和低覆盖度全基因组测序（LC-WGS）被引入，在保持高分辨率变异检测的同时，大幅降低了测序成本。例如，UCdetector模型对小肿瘤的检出率达78%；UCseek技术在0.3×–0.5×测序深度下，对低级别和早期肿瘤的检测准确度分别为91.8%和94.3%。深度测序技术通过多次独立测序反应，提高了检测低频率突变和罕见变异的灵敏度与准确性。例如，针对血尿患者的超深度测序（23个基因，443个突变）对早期疾病的检测灵敏度达87.3%，特异性达84.8%。uCAPP-Seq技术在预测免疫治疗适用性方面也表现出色。
3.2. 尿液DNA甲基化检测技术
DNA甲基化是重要的表观遗传修饰。甲基化特异性PCR（MSP）技术因其高灵敏度和特异性，成为尿液甲基化检测的基础平台。通过检测关键基因（如DMRTA2、HOXA9、PCDH17等）的甲基化状态，构建的多标志物模型在早期膀胱癌检测中表现出色。例如，检测四个甲基化标志物的组合，灵敏度可达90.5%，阳性预测值（PPV）达100%。优化的双标志物面板对早期膀胱癌的灵敏度达91.2%，远超尿液细胞学（55.6%），可减少约30%不必要的膀胱镜检查。EpiCheck系列研究显示其NPV高达95.1%~99.3%，可减少超过80%的膀胱镜检查。
DNA甲基化检测技术通过高通量分析多个基因的甲基化模式，结合突变状态和临床参数，构建了更复杂的预测模型。例如，结合SNaPshot甲基化分析与基因突变检测构建的模型，在血尿患者中的NPV达99.6%~99.9%。基于八标志物（FGFR3和TERT突变 + OTX1和ONECUT2甲基化）的模型，AUC在0.929至0.971之间，能实现精准风险分层。
基于NGS的全基因组甲基化分析技术，如全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS），能够无偏扫描全基因组甲基化模式，识别差异甲基化区域（DMR）。研究发现32个基因的甲基化特征可完全区分低级别和高级别膀胱癌。GUseek系统通过浅层WGBS整合甲基化和拷贝数变异（CNV），对泌尿生殖系统癌症的检测准确度超过95%。UroMark检测基于150个CpG位点的NGS分析，在验证队列中AUC达97%，灵敏度98%，特异性97%。此外，基于cfDNA片段化模式推断甲基化状态的片段组学甲基化分析（FRAGMA）技术，为分析小肿瘤释放的微量cfDNA提供了新方法。
3.3. 尿液RNA检测技术
3.3.1. mRNA检测技术
早期研究通过引入标准化工作流程（如外部RNA对照），为尿液mRNA标志物的可靠分析奠定了基础。例如，ETS2/uPA mRNA比值检测膀胱癌的特异性达100%，AUC为0.929。随着高通量技术的发展，研究从单基因分析转向多基因组合建模。例如，GS_D2模型（IGF2和MAGEA3）对高风险肿瘤的AUC达0.918，灵敏度94.74%。对CAIX剪接变体的研究发现，全长异构体比例在癌症患者中显著升高，AUC为0.837。NDRG2 mRNA在膀胱癌患者尿液中显著下调，结合蛋白水平验证，AUC达0.888。在临床效用探索中，Cxbladder Monitor等模型通过结合基因表达与临床数据，实现了高效的“排除”检测，灵敏度达91%，NPV达96%。基于机器学习的UriBLAD模型（32个基因）进一步突破性能瓶颈，在验证队列中AUC达0.93。
3.3.2. miRNA检测技术
miRNA稳定存在于尿液中，早期通过微阵列芯片结合qPCR验证筛选差异分子。例如，miR-1255b-5p对浸润性癌的灵敏度达85%。NGS推动了miRNA检测进入全基因组时代。例如，通过NGS筛选出的三种核心miRNA组合模型，区分膀胱癌与对照的AUC为0.70。有研究将端粒酶延伸反应与氧化石墨烯（GO）信号放大结合，提高了对早期小肿瘤中低含量miRNA的检测能力。创新性地整合miRNA与表面增强拉曼散射（SERS）并利用机器学习构建组合模型，区分膀胱癌与对照的AUC达0.92。尿液细胞外囊泡（EV）中的miRNA因囊泡保护而更稳定。例如，尿液EV中的miR-21-5p诊断灵敏度75.0%，特异性95.8%。通过TaqMan微阵列建立的6-miRNA特征，总体诊断AUC为88.3%。
3.3.3. lncRNA检测技术
长链非编码RNA（lncRNA）因其序列长、稳定性高而成为新兴靶点。例如，基于金纳米颗粒（Au-NP）杂交法检测lncRNA-UCA1，无需PCR，30分钟内通过颜色变化完成检测，灵敏度92.1%，特异性93.3%。基于qRT-PCR和微阵列筛选的双lncRNA组合（uc004cox.4上调和GAS5下调），在验证队列中AUC达0.885，显著优于尿液细胞学。基于基因组不稳定性生物信息学分析构建的5-lncRNA特征（GllncSig），与膀胱癌总生存期和化疗敏感性相关。
尽管多组学和NGS技术在识别基因组生物标志物和提高诊断准确性方面能力强大，但其广泛应用仍受限于较高的检测成本以及对设备、专业技术和数据管理系统的额外投资需求。
4. 蛋白/肽生物标志物检测技术
蛋白质/肽生物标志物因其与肿瘤发生和侵袭的强功能相关性，成为无创膀胱癌检测的核心靶点。酶联免疫吸附试验（ELISA）是广泛应用的技术，但面临分析挑战。近年来的核心突破集中在低丰度蛋白捕获、信号放大和多生物标志物整合三个方向，呈现出“纳米技术+AI”的融合创新趋势。
4.1. 蛋白质组学技术
多重尿液蛋白面板经过多中心外部验证，为临床应用奠定了基础。例如，一个面板在检测膀胱癌时AUC为0.87，对早期肿瘤灵敏度达83%。Oncuria检测针对10种关键分析物（包括血管生成素、IL-8、VEGF-A等），表现出高诊断准确性。最新研究聚焦于低丰度蛋白的深度捕获和多源数据整合。例如，利用Fe3O4@SiO2纳米颗粒构建尿液纳米蛋白冠，并结合血清和尿液蛋白质组数据，通过迁移学习算法构建的诊断模型，在1056个多中心样本中AUC达0.996。
4.2. 表面增强拉曼散射（SERS）传感器
SERS是一种灵敏、免标记、具有分子特异性的无创检测技术。基于血清的SERS平台区分非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）和肌层浸润性膀胱癌（MIBC）的AUC达0.983，准确度93.2%。在临床前大鼠模型中，SERS平台对早期膀胱癌的诊断准确度达99.6%（AUC>0.996），能在可见肿瘤形成前检测到细微的核苷变化。针对低级别膀胱癌漏诊问题，“SERSomes”通过分析每个样本的多个独立光谱集，结合随机森林机器学习，对低级别膀胱癌的诊断准确度达89.47%（AUC 0.88）。基于MXene@金纳米颗粒复合基底的尿液SERS传感器，对膀胱肿瘤抗原（BTA）的检测限低至0.1 pg/mL，在210个临床样本中区分膀胱癌患者与健康对照的灵敏度为91.7%，特异性93.3%。
无需样本预处理的相分离和酶响应即时检测（POC）技术为膀胱癌早期诊断建立了新范式。最新开发的BLOOM系统利用透明质酸酶（膀胱癌特异性生物标志物）触发双水凝胶膜降解，释放封装的低密度有机水凝胶信号颗粒，通过浮力自主迁移至油相产生溶剂诱导荧光，实现信号的空间分离与读取。该系统可直接分析原始尿液样本，结合智能手机荧光检测器，每次检测成本约2.5美元，非常适合家庭自测。在105个样本的双盲验证中，检测早期膀胱癌的AUC为0.93，灵敏度和特异性均为88%。
5. 代谢组学诊断技术
代谢组学相关技术通过检测小分子代谢物的变化来识别潜在的诊断生物标志物。
5.1. 高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）技术
早期研究采用HPLC-MS对尿液样本进行代谢组学分析，能区分健康个体与膀胱癌患者。采用超高效液相色谱（UPLC）与质谱联用进行非靶向代谢组学分析，筛选出的27种差异代谢物组合，区分膀胱癌患者与无癌对照的AUC达0.951，灵敏度91.2%，特异性86.8%。研究发现对甲酚葡糖苷酸可作为膀胱癌的诊断生物标志物（AUC=0.79）。另一项研究通过UPLC-MS识别了208种代谢物，筛选出19种差异代谢物，主要涉及苯乙酸盐代谢、丙酸代谢和脂肪酸代谢等通路。进一步通过随机森林、支持向量机和Boruta算法筛选出11种潜在生物标志物构建的逻辑回归模型，ROC曲线的AUC达0.983，灵敏度95.3%，特异性100%。
5.2. 气相色谱-质谱（GC-MS）技术
利用全二维气相色谱-飞行时间质谱（GC×GC TOF MS）的高分辨率优势，检测尿液挥发性有机化合物（VOC）。通过顶空固相微萃取结合GC×GC TOF MS，筛选出12种显著差异的VOC，其中6种代谢物仅存在于膀胱癌患者尿液中。基于这12种VOC构建的随机森林诊断模型，在训练集中灵敏度89%、特异性94%，验证集中灵敏度85%、特异性91%。多中心队列研究验证了8种先前发现的差异VOC，基于此构建的逻辑回归模型在外部验证中AUC为0.77，灵敏度71%，特异性72%。
5.3. 气相色谱-离子迁移谱（GC-IMS）技术
GC-IMS结合了色谱分离能力和高灵敏度离子迁移谱的优势，典型检测时间少于30分钟，且无需复杂样品前处理，操作简单，便于携带。一项临床研究使用GC-IMS设备分析尿液顶空气中的VOC，仅需10分钟检测时间。该技术区分膀胱癌与非癌人群的AUC达0.95，灵敏度87%，特异性92%；区分膀胱癌与前列腺癌的AUC高达0.97。研究还鉴定了13种膀胱癌特异性VOC生物标志物。另一多中心研究采用无需样品前处理的快速GC-IMS方法，成功鉴定出23种VOC，检测限低至4.66 ppb，其结果与传统GC-MS技术高度一致。
6. 结论与展望
用于膀胱癌早期诊断的无创尿液检测技术已从依赖形态学观察的传统细胞学，发展到基于多组学生物标志物的分子诊断。人工智能（AI）显著提升了尿液细胞学图像分析的自动化水平和准确性。基因组技术（包括PCR和NGS）可高通量、高灵敏度地检测DNA突变、拷贝数变异和甲基化模式。转录组学、蛋白质组学和代谢组学进一步从功能角度揭示了肿瘤的特征分子谱。总体而言，这些进展将传统方法对低级别早期肿瘤低于50%的检测灵敏度提升至80%以上，部分技术的AUC值甚至超过0.95。
然而，关键挑战依然存在。首先，缺乏标准化和临床验证，导致不同平台和操作程序的结果异质性高。因此，需要大规模、前瞻性多中心研究来建立统一标准。其次，对早期微小肿瘤的检测仍有局限，现有生物标志物在低肿瘤负荷或原位癌病变中的丰度和特异性有待提高。第三，成本与性能之间存在权衡，高灵敏度技术的高成本阻碍了其在初级保健和人群筛查中的应用。
为应对当前局限，未来发展预计聚焦于四个方向：多组学整合与AI驱动分析相结合，构建多维诊断模型；创新便携式即时检测和家庭检测设备；应用液体活检进行动态监测；以及通过制定统一的多中心试验标准化实施方案并进行大规模验证，解决当前领域“缺乏标准化”的核心瓶颈。通过多学科融合与技术整合，无创尿液诊断方法正逐步成为膀胱癌早期筛查、精准诊断和综合管理体系中的重要组成部分。
