L-肉碱作为一种生物相容性的二肽载体，用于非晶态波生坦的口服递送：二元体系

《International Journal of Pharmaceutics》：L-carnosine as a biocompatible dipeptide carrier for oral delivery of amorphous bosentan: the binary systems

L-carnosine的机械激活制备及与bosentan共晶系统形成研究，发现46:54比例下形成单一相共晶，显著提升药物溶解度和肠道渗透性。

　　

多米尼克·斯特罗耶夫斯基（Dominik Strojewski）|米哈尔·杜达（Micha? Duda）|阿格涅什卡·斯科尔斯卡-斯塔尼亚（Agnieszka Skórska-Stania）|娜塔莉亚·戈尔斯卡（Natalia Górska）|格涅沃米尔·拉塔奇（Gniewomir Latacz）|玛雅·库德里卡（Maja Kudrycka）|弗洛伦斯·达内德（Florence Danède）|洛朗·帕库（Laurent Paccou）|扬尼克·吉内（Yannick Guinet）|阿兰·埃杜（Alain Hédoux）|让-弗朗索瓦-威拉尔（Jean-Fran?ois-Willart）|安娜·克鲁帕（Anna Krupa）

雅盖隆大学医学院药学系，药物技术与生物制药学教授，波兰克拉科夫Medyczna 9号，30-688

摘要

在这项研究中，首次探讨了多功能且生物相容的二肽L-肉碱在制备药物制剂中的功能性。考虑到该二肽在有机溶剂中的热不稳定性和有限的溶解度，我们建立了在常温条件下对其进行机械活化的方案，以制备无定形L-肉碱并描述其性质。随后，通过高能球磨法制备了含有难溶性药物博森坦水合物模型和L-肉碱的二元固体制剂，其比例分别为46:54（重量%）、72:28（重量%）和88:12（重量%）。X射线粉末衍射（XRPD）、差示扫描量热法（DSC）和拉曼光谱技术的结合表明，从机械无序的博森坦晶体中释放的水分子使得L-肉碱无法发生无定形化；只有当结晶药物与无定形L-肉碱以相似的重量比（46:54）共磨时，才能形成单相共无定形体系。当结晶药物的比例（72%）高于无定形L-肉碱的比例（28%）时，L-肉碱的纳米晶体分散在无定形博森坦基质中。进一步增加药物的比例（88%）后，形成了L-肉碱的微晶体分散在无定形博森坦中的体系。两阶段生物相关性溶解实验的结果显示，单相和双相固体制剂都能形成过饱和溶液，但单相共无定形制剂的过饱和程度更高，且在肠道阶段没有药物沉淀现象。这些发现还得到了Caco-2细胞单层体外渗透性研究结果的支持，结果显示，含有L-肉碱的单相共无定形体系的博森坦渗透性比单独使用药物时高60%。

引言

近年来，对多功能辅料的需求日益增加，尤其是天然来源的辅料，这些辅料有助于加速患者友好型药物制剂的设计（Auerbach, 2025）。这一方面对于慢性疾病治疗尤为重要，因为药物与辅料之间的药效协同作用可以使治疗更加安全和有效。为了应对这一挑战，我们首次尝试评估生物相容性二肽L-肉碱作为共无定形制剂基质的可行性，该制剂含有难溶性药物博森坦水合物模型。

L-肉碱（β-丙氨酰-L-组氨酸）是一种内源性分子，100多年前在一种名为Liebig肉提取物的历史食品中被发现（Boldyrev, 2012）。此后，人们开发了许多L-肉碱的合成方法，并不断优化以满足其日益增长的健康促进作用需求（Facchetti et al., 2025）。关于L-肉碱的生理和生化特性的详细信息超出了本研究的范围，可参考其他文献（Boldyrev et al., 2013, Kumar et al., 2025）。简而言之，L-肉碱的生理功能主要通过以下六条途径实现：（i）缓冲作用，（ii）金属离子螯合作用，（iii）抗氧化作用，（iv）抑制蛋白质羰基化和糖基化，（v）刺激蛋白酶活性以清除异常蛋白质和肽，以及（vi）调节一氧化氮（NO）代谢。有趣的是，由于含有咪唑单元（图1），L-肉碱在骨骼肌和心肌中起到生理缓冲作用，可提高运动员的体力耐受力。此外，组氨酸部分能与锌、镉、钴和铜等金属形成螯合物，从而发挥神经保护作用，对抗金属引起的毒性（Torreggiani et al., 2002, Torreggiani et al., 2000）。L-肉碱还被认为是一种强效的水溶性抗氧化剂，作为单线态氧清除剂，可保护细胞膜免受氧化应激。这些特性使其具有抗炎、抗增殖、促进认知、抗糖尿病或降压等作用（Boldyrev et al., 2013, Gaafar et al., 2021, Kumar et al., 2025, Siracusa et al., 2020, Yan et al., 2024）。因此，已进行了大量临床试验（ClinicalTrials.gov）来评估L-肉碱的治疗潜力，主要针对神经退行性疾病（Hisatsune et al., 2016）、精神疾病、自闭症、脊髓损伤、糖尿病和肥胖症，以及预防放射治疗和化疗或有害环境因素（如颗粒物）引起的副作用（Baba et al., 2024）。最新研究表明，L-肉碱还可以缓解海湾战争综合症的症状（Baraniuk et al., 2013, Collier et al., 2024）。尽管L-肉碱耐受性良好，但其治疗用途受到口服或静脉给药后快速酶降解的限制（Zhang et al., 2024）。因此，L-肉碱目前仅作为膳食补充剂使用，通常以高剂量（每天0.5–2克）口服。然而，长期使用L-肉碱补充剂的经验为其安全性提供了重要依据。

从化学角度来看，L-肉碱含有三个可电离基团（图1）：羧基（pKa = 2.76）、咪唑环（pKa = 6.72）和胺基（pKa = 9.32）。在生理条件下，羧基和胺基会电离形成两性离子。在中性pH值下，咪唑环存在两种互变异构形式，其中互变异构体I [Nτ质子化] 比互变异构体II [N?质子化] 更稳定（Boldyrev et al., 2013）。咪唑环中的氮质子化也被用于开发L-肉碱与有机酸的分子盐（Shemchuk et al., 2017）。

低分子量共成形剂（主要是氨基酸（L?bmann et al., 2013b, L?bmann et al., 2013a, Wu et al., 2021）、羧酸（Fung et al., 2018a, Fung et al., 2018b）以及活性药物成分（如西咪替丁（Alles? et al., 2009）或西地那非碱（Strojewski et al., 2024）对含有难溶性药物的共无定形制剂性能的积极影响已被广泛研究（Liu et al., 2021, Yarlagadda et al., 2021）。此外，也有报道指出二肽在共成形性、增强溶解度或稳定无定形形态方面优于共无定形氨基酸制剂（Wu et al., 2021, Wu et al., 2019, Wu et al., 2018）。然而，关于它们实用性的数据仍然有限，据我们所知，L-肉碱尚未被用作无定形固体制剂的基质。因此，目前缺乏关于L-肉碱无定形化及其性质的数据。

因此，本研究旨在分析：（i）L-肉碱是否可以通过机械活化实现无定形化；（ii）与L-肉碱共磨时博森坦是否会发生无定形化；（iii）通过球磨二元物理混合物是否可以形成单相共无定形体系；（iv）L-肉碱是否有助于在生物相关流体中制备过饱和的博森坦溶液；最后（v）确定L-肉碱对药物肠道渗透性的影响。

先前的研究表明，博森坦水合物易于形成玻璃态，并具有较高的玻璃稳定性（Krupa et al., 2022, Strojewski et al., 2024）。当博森坦水合物与结晶西地那非碱进行高能球磨时，形成了单相共无定形体系，从而在生物相关流体中实现了高水平的博森坦过饱和（Strojewski et al., 2024）。因此，我们采用了相同的制造方法和工艺参数来制备含有博森坦和L-肉碱的无定形体系。为了阐明相变机制并描述这两种化合物机械活化后形成的无序状态结构，结合使用了X射线粉末衍射（XRPD）和差示扫描量热法（DSC）以及拉曼光谱技术，并通过两阶段生物相关性溶解和渗透性实验对其性能进行了评估。

材料

博森坦一水合物（BOS，分子量 = 569.63 g mol?1）从波兰Gdynia的Biolim公司获得。二肽L-肉碱（CAR，分子量 = 226.23 g mol?1）从波兰Poznań的STI公司购买。36%（v/v）的分析级盐酸从波兰华沙的Merck公司购买。无水氯化钠、氢氧化钠和磷酸氢钠从波兰克拉科夫的Krakchemia S.A.公司购买。所有上述试剂均为分析级。色谱级乙腈（ACN）也来自同家公司。

球磨条件对L-肉碱结晶度和热性质的影响

L-肉碱是一种具有明确晶体结构的二肽（Barrans et al., 1976）。结晶L-肉碱的DSC加热扫描显示熔化过程吸热，起始温度为240°C，表明晶体结构较为刚性；热重曲线显示从熔化开始时重量损失约为30%（图S4）。这一结果与已发表的数据一致（Vrane? et al., 2021, Zhou et al., 2020），这些数据表明L-肉碱在加热过程中会发生分解。

结论

在本研究中，首次在常温条件下通过机械活化获得了无定形L-肉碱。当博森坦水合物与无定形L-肉碱共磨时，形成了单相共无定形体系。两阶段生物相关性溶解实验表明，这种制剂优于纯结晶药物和双相二元固体制剂。这些发现还得到了渗透性研究结果的支持。

CRediT作者贡献声明

多米尼克·斯特罗耶夫斯基（Dominik Strojewski）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，资源获取，方法学研究，资金申请，数据分析，概念化。米哈尔·杜达（Micha? Duda）：可视化，方法学研究，数据分析。阿格涅什卡·斯科尔斯卡-斯塔尼亚（Agnieszka Skórska-Stania）：撰写 – 原稿，可视化，监督，方法学研究，数据分析，概念化。娜塔莉亚·戈尔斯卡（Natalia Górska）：方法学研究，数据分析。格涅沃米尔·拉塔奇（Gniewomir Latacz）：验证。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了波兰国家科学中心资助的Sonata Bis项目（编号DEC-2019/34/E/NZ7/00245）以及雅盖隆大学“优先研究领域qLIFE”战略计划下的资助，同时利用了Smart Growth Operational Program POIR 4.2项目（编号POIR.04.02.00-00-D023/2）提供的研究基础设施。