《Plants》：Defining the Optimal Microspore Developmental Window for Efficient Anther-Derived Somatic Embryogenesis in Rubber Tree (Hevea brasiliensis)
Yinglian Wu,
Naushad Alam,
Xing Bao,
Suna Peng,
Rizhi Wu,
Chenrui Gu,
Xinran Ou,
Haobin Liu,
Xiaoyi Wang and
Tiandai Huang
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橡胶树花药体细胞胚发生是育种中的重要手段，但其效率受小孢子发育阶段影响显著。本研究针对该问题，以品种‘热研73397’为材料，系统分析了花蕾外部形态与内部小孢子发育阶段的关联，并通过体外培养明确了单核小孢子阶段（特别是早单核期）的胚性潜力最高，其对应的花蕾横径为1.42–1.57 mm，颜色为绿至黄绿色。研究还证实胚性组织来源于花药壁二倍体体细胞，并据此建立了一套基于花蕾直径、颜色和筛分法的快速、非破坏性外植体筛选方案，为优化橡胶树花药培养效率提供了重要实践基础。
橡胶树（Hevea brasiliensis）是全球天然橡胶的主要商业来源，其种植对我国及全球相关产业至关重要。然而，作为典型的异交、雌雄同株树种，传统的育种方法依赖人工授粉，不仅耗时耗力，而且群体高度杂合的特性使得通过种子繁殖稳定遗传优良性状变得困难。因此，利用组织培养等生物技术手段进行无性繁殖和品种改良成为研究热点。其中，花药培养（Anther culture）是一项关键技术，理论上可以通过诱导小孢子（microspore）发育成单倍体（haploid）再经染色体加倍，快速获得纯合植株，大幅提升育种效率。然而，在橡胶树中，分离的小孢子培养尚未成功诱导出单倍体植株，且大多数植物物种中，花药培养再生的植株主要来源于花药壁的体细胞组织，而非小孢子本身。尽管如此，来自花药的高效二倍体体细胞胚发生（Somatic embryogenesis）依然极具价值，因为它为克隆繁殖、变异筛选、基因编辑和种质保存提供了理想的实验体系。在这一体系中，小孢子的发育阶段被认为是影响胚性诱导效率的关键因素，但具体在橡胶树中，小孢子发育阶段如何调控花药体细胞胚发生，其最佳“窗口期”是什么，以及能否通过快速的外部形态指标进行判断，这些关键问题尚不明确。针对此，研究人员在《Plants》期刊上发表了他们的研究成果。
为了开展此项研究，作者主要运用了以下关键技术方法：首先，对采集自中国热带农业科学院橡胶研究所试验田的橡胶树品种‘热研73397’的花序进行采样，并依据花蕾形态特征（如长度、横径、颜色）进行初步分组。接着，通过卡宝品红染色制片（Cytological analysis）和光学显微镜观察，精确鉴定小孢子的六个连续发育阶段：小孢子母细胞期、四分体期、早单核期、晚单核期、二核期和成熟花粉期。在此基础上，将不同发育阶段的花药接种到改良MS（Murashige and Skoog）培养基上进行愈伤组织诱导和体细胞胚诱导培养。最后，利用石蜡切片和组织学染色（Histological analysis）技术，追踪了愈伤组织和胚性结构的起源与发育过程，明确了其体细胞来源。
2. 结果
2.1. 小孢子发育研究
研究人员通过细胞学观察，明确了小孢子发育的六个阶段，并测量记录了各阶段对应的花蕾形态特征。研究发现，小孢子发育阶段与花蕾长度、宽度和颜色等外部形态存在显著关联。例如，处于早单核期（early uninucleate stage）的花蕾，其平均长度约为2.34 mm，平均横径约为1.42 mm，颜色为绿色。研究还观察到，同一花序内甚至同一花药的不同药室间，小孢子发育存在不同步性，但单个花药内通常以一个主要发育阶段为主导。
2.2. 愈伤组织诱导
花药的愈伤组织诱导效率与小孢子发育阶段显著相关。诱导效率随着花药成熟度提高而增加，在早单核期达到峰值（100%），晚单核期（98.81%）和二核期（97.62%）次之，这三个阶段被归为同一高响应组。而处于小孢子母细胞期和四分体期的花药诱导率显著较低。此外，高响应阶段（早单核期至二核期）的愈伤组织在三周内即可启动，而早期阶段则需要大约四周。综合诱导率和愈伤组织质量评分，早单核期至二核期是橡胶树花药诱导愈伤组织的最有利窗口期。
2.3. 体细胞胚发生与植株再生
体细胞胚发生效率同样受小孢子发育阶段显著影响。胚性愈伤率在早单核期最高（29.76%），显著高于二核期（12.2%），而小孢子母细胞期和四分体期则完全未能诱导出体细胞胚。在可响应阶段中，早单核期、晚单核期和二核期分别产生了8个、6个和3个子叶胚。随后的植株再生实验共获得5株再生苗，其中4株来自早单核期（再生率50%），1株来自晚单核期（再生率16.67%），而二核期诱导的胚胎未能再生出植株。因此，早单核期和晚单核期被确定为橡胶树花药来源愈伤组织进行体细胞胚诱导和植株再生的最佳发育阶段。
2.4. 花药发育阶段对愈伤诱导和胚形成的显微研究
组织学分析表明，在培养21天后，处于早、晚单核期和二核期的花药表现出明显的药室肿胀，并已脱分化为明确的愈伤组织团块。活跃的细胞分裂在包括表皮、内皮层、连接组织和花丝在内的多种体细胞组织中均被观察到。相比之下，小孢子母细胞期和四分体期的花药在此时尚未表现出明显肿胀，其细胞分裂活动也主要局限于连接组织和花丝。培养35天后，在晚单核期和二核期来源的愈伤组织中观察到了具有分化原表皮层的真正球形胚，而在四分体期和早单核期来源的愈伤组织中观察到的结构则被鉴定为类似球形胚的细胞聚集体，缺乏分化的原表皮层。这些观察结果共同表明，橡胶树的花药来源愈伤组织主要起源于花药壁的二倍体体细胞组织，包括表皮、内皮层、连接组织和花丝。初始的小孢子发育阶段强烈影响愈伤组织的发育进程。
3. 讨论与结论
本研究表明，在橡胶树品种‘热研73397’中，花药培养的成功与供体组织的生理状态密切相关。胚胎起源于花药壁的体细胞组织而非小孢子。因此，小孢子的发育阶段应被理解为整体花药发育状态的指标，而非胚性能力的直接决定因素。含有早单核期至晚单核期小孢子的花药表现出最高的形态发生响应，但这很可能反映了这些阶段周围体细胞组织处于最佳生理状态。
研究建立了小孢子发育阶段与花蕾外部形态（如大小、颜色）之间的明确关联，为通过非破坏性形态指标筛选高响应外植体提供了实用方法。特别是，横径为1.42–1.57 mm、颜色为绿至黄绿色的花蕾与单核小孢子阶段高度吻合，该阶段具有最高的胚性潜力。将细胞学验证与快速、非破坏性的形态筛选相结合，为大规模外植体选择提供了一种实用且高效的方法。
组织学分析证实，愈伤组织的形成和随后的胚性结构发育均源于花药壁的二倍体体细胞组织，在研究的任何阶段均未观察到直接来自小孢子的胚胎发生。植株再生也仅限于来自单核期花药的胚胎，其中早单核期的再生率最高。
总之，本研究在测试的特定实验条件下，明确了橡胶树克隆‘热研73397’花蕾外部形态与内部小孢子发育阶段的关系，确定了单核期（特别是早、晚单核期）是进行花药培养实现高效愈伤诱导、体细胞胚形成和后续植株再生的最佳发育窗口。研究澄清了胚性组织的体细胞起源，并为通过结合花蕾直径、颜色和筛分法来高效选择有响应的外植体建立了可靠的形态学和细胞学标准。这些发现为优化橡胶树体外再生体系、推进其生物技术育种策略提供了坚实的实验基础。
