《Journal of Fungi》：Recent Advances in Pathogenicity and Biocontrol of Postharvest Penicillium Diseases
Guohua Yin,
Siyuan Zhao,
Han Zhang,
Kayla K. Pennerman and
Joan W. Bennett
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本文系统综述了导致苹果、柑橘等果蔬采后重大损失的青霉属病原菌。文章聚焦于其致病机制与生物防治策略的最新研究进展，核心内容包括：(1) 利用CRISPR-Cas9和ATMT(根癌农杆菌介导转化)等技术，功能解析了PacC、PeStuA、FlbC等致病性与杀菌剂抗性相关基因；(2) 阐述了展青霉素(patulin)等霉菌毒素的生物合成与风险；(3) 深入探讨了基于RNA干扰(RNAi)的宿主诱导基因沉默(HIGS)和喷施诱导基因沉默(SIGS)等非转基因生物防治新策略；(4) 综述了气候变化的影响及人工智能(AI)辅助研究等前沿方向，为果蔬采后病害的可持续治理提供了全面参考。
2. 致病性基因功能的系统分析
在揭示青霉属物种致病性的遗传基础方面，基因组学和功能分析工具的进步推动了重要进展。根癌农杆菌介导转化已在扩展青霉和意大利青霉中得到成功优化，用于构建突变体库和鉴定新的致病决定因子。RNA干扰等RNA方法的运用，进一步揭示了意大利青霉中存在跨界RNA干扰机制，沉默其Dicer-like基因Pit-DCL2可降低真菌毒力。代谢组学引导的功能遗传学还发现，非核糖体肽合成酶HcpA是产生环肽（如真菌孢菌素）所必需的，这些环肽在柑橘感染过程中可作为时间调控的毒力因子。
青霉菌的细胞壁结构曾为其遗传转化带来巨大挑战。2022年，Garrigues等人开创性地成功为指状青霉和扩展青霉建立了高效的CRISPR-Cas9系统。该系统基于AMA1骨架的自复制质粒，其关键优势在于可回收性——基因编辑完成后，质粒可被消除，实现无标记编辑，并允许在同一菌株内进行多轮遗传操作。作者通过靶向调控孢子发育的wetA基因验证了该系统，成功获得了生长速率降低、产孢缺陷和致病性改变的突变株。未来，新的CRISPR-Cas9策略将为病原性青霉的大规模精准基因功能研究提供强大平台。
2.1. 方法论工具深化了对青霉致病性的理解
2.2. 指状青霉
利用CRISPR和早期的ATMT技术，一系列对指状青霉毒力至关重要的基因功能得到了验证。pH响应转录因子PacC作为一个全局毒力调节因子，其缺失导致致病性完全丧失，证实了病原体通过pH调节适应宿主微环境。几丁质合成酶基因PdChsVII和O-甘露糖基转移酶基因Pmt2的缺失会严重损害细胞壁完整性，从而削弱真菌生长和感染能力，凸显了细胞壁生物发生在致病性中的关键作用。MAPK信号通路中Fus3/Kss1的同源物PdMpkB发生突变，会使病原体几乎无法引起果实腐烂，表明该激酶对感染不可或缺。
Garrigues等人在2020年鉴定出一种独特的富含半胱氨酸的阴离子分泌蛋白Sca。尽管该蛋白本身没有直接的抗菌活性，但其过表达或外源施用能显著提高指状青霉在柑橘果实上的侵染成功率。其作用机制是，Sca能有效抵消宿主产生或外源施用的抗真菌蛋白（如AfpB和PeAfpA）的保护作用。Sca代表了一类不直接参与基础代谢，而是用于微调宿主互作、提高感染效率的毒力增强因子。主要易化子超家族转运蛋白基因PdMfs1和PdMfs2的突变会导致指状青霉对柑橘果实的毒力降低。这些转运蛋白可能参与了毒性化合物（如色胺喹唑啉）的分泌，从而影响致病性。
功能基因组学研究阐明了调控青霉致病性的复杂网络。转录因子PdSte12对柑橘感染过程中的产孢和毒力至关重要，它可作为编码转运蛋白和甾醇脱甲基酶基因的调节因子。类似地，有丝分裂原活化蛋白激酶PdSlt2控制产孢和感染，同时也是多种转运蛋白编码基因（如ATP结合盒转运蛋白和MFS转运蛋白）的负调控因子。主要易化子超家族转运蛋白具有多方面的作用，PdMFS1同时贡献于杀菌剂抗性和毒力，而PdMFS2-5在病原体-果实互作中表现出不同的功能。甾醇14α-脱甲基酶PdCYP51B通过启动子修饰增强了脱甲基抑制剂抗性和真菌毒力。最近鉴定的PdMFS6转运蛋白与化学敏感性和侵染力有关。值得注意的是，转录因子PdMut3对毒力施加负调控，其缺失意外地增加了柑橘感染期间的致病性，揭示了复杂的转录控制机制。
2.3. 扩展青霉
在阐明扩展青霉和意大利青霉致病性的遗传基础方面也取得了重大进展，这两种病原菌基础基因组序列的发表为了解其毒力机制和宿主特异性提供了关键信息。APSES家族转录因子PeStuA已被确定为一个核心调控枢纽，全局控制扩展青霉的菌丝生长、无性产孢、毒力和展青霉素生物合成。乙酸转运蛋白PepatA通过调节乙酸代谢，正向调控产孢和展青霉素积累。这些发现建立了该真菌基本发育过程、次级代谢和致病性之间的紧密联系。
基因组分析表明，扩展青霉拥有一个完整的包含15个基因的展青霉素生物合成基因簇。相比之下，指状青霉和意大利青霉缺乏此完整基因簇，这解释了为何扩展青霉能产生展青霉素而其他侵染柑橘的物种不能。功能研究已证实PePatL和PePatK在展青霉素生物合成中起关键作用；然而，展青霉素的产生与扩展青霉的毒力并不直接相关。扩展青霉的基因组（33.52 Mb）大于指状青霉和意大利青霉，并且含有更多数量的碳水化合物活性酶和次级代谢物生物合成基因簇。这种扩展的遗传库可能有助于扩展青霉更广泛的宿主范围。值得注意的是，扩展青霉特有的果胶降解酶，特别是属于GH78家族的酶，可能为其能够侵染苹果和梨等多种果实提供了分子基础。
2.4. 意大利青霉
意大利青霉的致病性由涉及信号传导、表观遗传调控和结构完整性的复杂遗传网络控制。基因PiCaMK1、PiSntB和Piwsc1都是这些网络中的关键节点。敲除其中任何一个都会显著损害真菌的生长、繁殖和致病能力，使其成为RNAi技术的理想靶点。RNAi可通过向柑橘果实喷施针对这些基因转录本设计的双链RNA分子来“沉默”这些必需基因。例如，靶向PiCaMK1的dsRNA会破坏钙信号传导，阻碍生长和应激反应；沉默PiSntB可引发碳饥饿反应和自噬；而靶向Piwsc1则会损害细胞壁完整性，减少孢子萌发和病斑形成。由于这些基因对意大利青霉至关重要，且在植物或哺乳动物中没有已知的对应物，基于RNAi的杀菌剂可为控制采后青霉病提供一种高度特异、可持续且环境友好的策略。
2.5. 杀菌剂抗性调控的新机制
随着杀菌剂的广泛使用，杀菌剂抗性已成为日益严峻的挑战。CRISPR技术促进了对不依赖于靶基因（如CYP51）突变的新抗性机制的发现。Xi等人（2024年）结合转录组学分析和基于CRISPR的基因敲除，鉴定出转录因子FlbC是指状青霉对DMI类杀菌剂（如抑霉唑）抗性的关键正调控因子。有趣的是，尽管ΔFlbC突变体对抑霉唑表现出超敏性，但其细胞内麦角甾醇水平保持不变。这表明FlbC调控一条独立于麦角甾醇生物合成途径的新抗性信号通路。早期研究已表明，甾醇调节元件结合蛋白同源物PdSreA和PdSreB通过调控多个甾醇生物合成基因（包括CYP51）的表达，影响指状青霉对DMI类杀菌剂的敏感性。主要易化子超家族转运蛋白是青霉属中关键的多重耐药决定因子，作为药物-H+反向转运体主动外排杀菌剂。在指状青霉中，PdMFS1-6介导了对多种杀菌剂类别的不同抗性，并将化学敏感性与毒力联系起来。扩展青霉的多重耐药菌株持续过表达PeMFS1-2，这些转运蛋白也促进展青霉素的外排。ABC转运蛋白也常与真菌的杀菌剂抗性相关。这些发现共同描绘了一个涉及多层转录因子的复杂杀菌剂抗性调控网络。
2.6. 未来研究方向
CRISPR-Cas9技术的应用已成功地将采后青霉病原生物学研究从传统的单基因功能验证推进到系统解析致病性和抗性调控网络的时代。当前研究不仅确认了经典的“毒力必需基因”，还将概念框架扩展到新定义的类别，如“毒力增强因子”（如Sca）和“专属抗性调节因子”（如FlbC）。这些发现丰富了我们对这些病原体侵染策略的理解。基于这些成果，未来研究方向可能包括：（1）应用CRISPR干扰和CRISPR激活进行精确的基因表达调控，以及进行全基因组功能缺失筛选以系统识别所有与致病性相关的基因；（2）对已识别的关键因子（如FlbC和Sca）进行深入的机理研究，以阐明其下游靶基因、互作蛋白及其发挥功能的完整信号通路；（3）利用这些新发现的致病性和抗性基因的分子靶点设计新型作用模式的杀菌剂，设计基于基因沉默的防控剂，并培育抗病果蔬品种。
3. 青霉采后病害的病原学与代谢物
青霉属物种的生态和生物学特性表现出深刻的区域差异。研究表明，青霉属物种在温带地区更为普遍，而在以曲霉属霉菌为主的干旱热带环境中则相对罕见。这种地理分布反映了它们在适应、生理和代谢潜力方面的根本差异。来自极地和高海拔地区的耐冷菌株表现出显著的耐冷性，而喜马拉雅地区的分离株则表现出多极端耐受性。相比之下，来自生物多样性热点地区（如巴西大西洋森林）的热带菌株则表现出适应更温暖、竞争性环境的独特物种组成和代谢特征。值得注意的是，来自受人类活动影响的南极栖息地的菌株比来自未受干扰地区的菌株能产生更多结构多样的次级代谢物。来自不同气候区的海洋来源青霉也产生不同的生物活性化合物。这些区域差异对于理解致病机制、预测真菌对气候变化的响应以及针对不同气候区制定靶向控制策略具有重要意义。
导致苹果采后青霉病的主要物种包括指状青霉、扩展青霉和意大利青霉。在侵染过程中，青霉属物种会产生多种多样的次级代谢物，包括生物碱、聚酮、萜类和霉菌毒素。其中许多化合物具有双重性质，既具有毒性，也具有有益的生物活性潜力。
3.1. 典型的霉菌毒素
主要由扩展青霉产生的展青霉素是与该物种相关的最重要的霉菌毒素。它具有免疫毒性、神经毒性和潜在的致癌性，使其成为苹果汁和果酱等加工苹果产品中重点监控的污染物。全球已制定了严格的监管限值。由光秃青霉产生的霉酚酸具有抗病毒和免疫抑制特性，但在高浓度下表现出细胞毒性效应。由疣孢青霉和诺迪克青霉产生的赭曲霉毒素A是一种以其肾毒性和致癌作用而闻名的霉菌毒素。它是水果及其制品中值得关注的污染物。桔青霉素由包括桔青霉和扩展青霉在内的许多物种产生。该化合物具有肾毒性，并常与赭曲霉毒素A共同存在，可能产生协同毒性作用。烟曲霉素C是一种神经毒性霉菌毒素。青霉属物种产生的同源化合物被认为具有类似的毒理学机制，值得进一步关注。
3.2. 生物碱
从沈通青霉中分离出的沈通宁A、B、C和D，其中沈通宁D对大肠杆菌表现出弱抗菌活性。其含氮杂环结构与毒性调节有关，值得进一步研究其潜在应用。来自青霉属菌株OUCMDZ-1435的迈勒格林显示出抗炎潜力。由于在高浓度下表现出细胞毒性，需要进一步研究以评估其治疗适用性。另一种经典的生物碱毒素青霉酸在哺乳动物细胞中表现出抗菌活性和细胞毒性，突显了其双重生物学效应。
3.3. 聚酮类活性成分
从光秃青霉SF-61290中分离出的异色原酮衍生物，如异色原酮XV和arvoredol，对结直肠癌HCT-8细胞表现出显著的细胞毒活性，其效力超过标准化疗药物5-氟尿嘧啶。属于弯孢霉菌素家族的弯孢霉菌素衍生物，包括脱氢弯孢霉菌素，对HCT116结直肠癌细胞的增殖表现出显著的抑制效果。
3.4. 其他代谢物
源自沈通青霉的脂肪酸和萜类化合物表现出潜在的代谢毒性，而光秃青霉产生的倍半萜类毒素则表现出抗菌活性和细胞毒效应。大环内酯类化合物，如布雷菲德菌素A衍生物，在抗癌研究中显示出良好的生物活性，突显了其作为抗肿瘤药物先导物的潜力。
4. 青霉病的综合防治
真菌病害占所有植物生物性病害的大部分，对全球作物生产和粮食安全构成严重威胁。这些毁灭性的真菌病害每年造成高达14%的作物产量损失。由于杀菌剂抗性的发展和对环境污染的担忧，传统的化学防治方法问题日益突出。常规的抗病育种方法通常耗时，而转基因技术的商业部署面临监管和公众接受度的挑战。基于RNA干扰的基因沉默技术已成为可持续管理真菌病害和霉菌毒素污染的有前景的替代方案。其中，宿主诱导基因沉默和喷施诱导基因沉默代表了发展最迅速的生态友好型防治策略。
4.1. 宿主诱导基因沉默
HIGS是一种基于RNAi的技术，涉及通过病毒载体或ATMT等方法将与病原体靶基因互补的dsRNA引入宿主植物。dsRNA在植物体内被植物内切核酸酶加工成小于扰RNA，然后装载到RNA诱导沉默复合体中。在病原体侵染时，这些siRNA被入侵的病原体摄取，并特异性沉默相应的靶基因，从而抑制病原体生长和侵染。这种方法不仅能够反向遗传学验证病原体基因功能，还有助于开发稳定遗传的抗病作物品种。
HIGS的概念最早于2010年由Nowara及其同事提出。此后，HIGS被广泛应用于研究小麦和棉花等作物的抗病性。成功的应用包括小麦叶锈病、小麦条锈病、棉花黄萎病和香蕉枯萎病的控制。例如，针对小麦条锈病菌PtCYC1和PsFUZ7基因的HIGS已产生稳定、高抗的小麦品系。同样，沉默大丽轮枝菌VdH1基因的转基因棉花对黄萎病表现出强抗性。在水稻稻瘟病和油菜菌核病的抗性种质开发方面也取得了进展，显著丰富了可用的抗性基因库。
尽管有潜力，HIGS技术存在一些局限性：目前的应用限于已建立遗传转化系统的作物物种，且育种过程通常耗时；载体的随机整合可能导致基因稳定性和脱靶效应；靶点选择需要识别病原体中高效靶基因，这仍然具有挑战性；由于涉及转基因生物的创建，其应用受到严格的监管监督和公众接受度问题的限制。
4.2. 喷施诱导基因沉默
SIGS是从HIGS发展而来的一种非转基因策略。它涉及将靶向病原体毒力基因的dsRNA或siRNA直接喷施到植物表面。基因沉默通过植物摄取和运输RNA分子或病原体直接摄取而触发。其基本机制依赖于跨界RNAi，细胞外囊泡和其他途径促进植物和病原体之间的核酸转移。通过避免基因改造，SIGS规避了与转基因作物相关的监管和伦理问题，同时提供了更短的开发周期。自推出以来，SIGS已在多种作物中展现出控制植物病害的巨大潜力，并于2023年美国环保署批准了首个靶向科罗拉多马铃薯甲虫的可喷施RNA生物农药，标志着其向商业应用的过渡。
SIGS策略可分为单靶点和多靶点方法。单靶点应用包括喷施靶向镰刀菌属CYP51基因的dsRNA以抑制大麦的赤霉病，以及靶向番茄枯萎病菌FolRDR1基因的dsRNA以减轻番茄枯萎病症状。多靶点方法涉及混合针对多个关键致病基因的dsRNA，可增强防治效果。例如，同时沉默禾谷镰刀菌的Chs7、Gls和Pkc基因可使小麦赤霉病病斑减少高达78%。SIGS的有效性已在小麦、水稻、番茄和棉花等多种作物中得到验证，并且可以与化学杀菌剂结合使用以减少农药总用量。
尽管前景广阔，SIGS技术也面临一些限制：环境不稳定性，裸露的dsRNA在田间环境中的半衰期短，易被核酸酶降解、雨水冲刷和紫外线辐射破坏；病原体摄取外源dsRNA的能力差异显著，例如炭疽菌属物种的摄取极少，而卵菌的摄取效率则因细胞类型和发育阶段而异；siRNA运输及与Argonaute蛋白相互作用的分子机制尚不清楚，特异性决定因素仍未完全明了；识别高效靶基因仍然困难，需要在靶病原体特异性和对多种病原体或分离株的广谱活性之间取得平衡。
4.3. 技术改进、增强与监管
HIGS和SIGS都面临脱靶效应和病原体可能产生抗性等挑战。这两种方法的机制都受复杂的RNAi网络调控。关键过程，如siRNA在宿主和病原体之间的转移以及基因沉默抑制子的作用，需要进一步研究。结合HIGS和SIGS可能会带来互补优势：SIGS的快速作用与HIGS提供的持续抗性相结合，可开发出更有效、更长久的病害管理策略。此外，利用植物内源或外源microRNA的跨界调节功能，为设计具有增强抗病性的新型HIGS方法提供了有前景的途径。
为了提高dsRNA的稳定性和递送效率，研究人员开发了各种递送系统。纳米载体（如壳聚糖、碳量子点和层状双氢氧化物）可以保护dsRNA免于降解，改善细胞摄取，并延长有效持续时间。源自植物病毒的蛋白质基球形纳米颗粒能够实现dsRNA的高效包封和土壤递送，通过保护dsRNA免受环境降解，实现对线虫的持续基因沉默。源自食品的载体和有益微生物基载体在安全性和成本效益方面具有优势。此外，大肠杆菌表达系统能够大规模生产dsRNA，降低制造成本，为工业化应用奠定基础。Yin及其同事成功地对大肠杆菌中的RNase III酶进行改造，使其能够将dsRNA切割成22-23 bp的siRNA，进一步提高了RNAi效率。
最近的田间试验也通过全面的非靶标生物评估验证了RNAi作物的环境安全性。在植物病理学领域，SIGS已进入针对真菌病原体的高级田间试验阶段。值得注意的是，研究人员开发了自组装三角形RNA纳米颗粒，靶向灰葡萄孢菌的四个毒力基因，与线性dsRNA相比，表现出更优异的持久性和功效。这种RNA纳米技术方法无需合成纳米载体，解决了生物相容性和环境持久性问题。除了农业，RNAi疗法在临床上取得
