《Journal of Chromatography A》：Enhanced instrumentation and preparative separation performance of orthogonal high-pressure electrochromatography
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正交高压电色谱（OHPEC）平面柱改进后实现连续分离，优化电极腔集成自动冲洗和除气功能，降低50%冲洗时间和溶剂消耗，柱效提升至3倍颗粒直径，实验验证温度波动<5%和pH稳定，适用于复杂混合物制备分离。
Rafa? Gajos | Tadeusz H. Dzido
卢布林医科大学药学院物理化学系，Chod?ki街4A号，卢布林，20-093，波兰
摘要
正交高压电色谱（OHPEC）将液相色谱与垂直施加的电场结合在填充式平面色谱柱中，相比基于色谱板的系统有了显著进步。本文报道了一种改进的OHPEC平面色谱柱，解决了早期配置的关键问题，并首次实验性地展示了该技术的连续分离能力。OHPEC系统可以以周期性或连续模式运行，根据目标化合物的色谱保留时间和电泳迁移率选择运行模式。重新设计的电极室配备了主动冲洗和脱气功能，集成到了全自动系统中，将冲洗时间和溶剂消耗量减少了50%，同时提高了抗焦耳热和水电解的稳定性。在1.0 kV电压下运行100分钟后，出口温度升高不到5%，pH值变化在1个单位以内，而早期设计中温度升高超过20%，pH值变化达到4个单位。改进的填充工艺将柱高从大约十个颗粒直径降低到三个颗粒直径，预计柱产生的峰宽可减少约40%。样品引入研究表明，多注射系统（基于活塞的固定体积循环替代方案）在较高注射量下产生的峰宽减少了10-20%。这些改进显著提高了OHPEC分离系统的实际通量。在2.5 kV下对测试混合物进行制备分离时，系统表现出良好的重复性，保留时间的RSD值低于1.6%，峰宽的RSD值低于3.6%，峰面积的RSD值低于5.2%。基于分析规模数据的理论建模可以为制备分离的操作参数提供有用的参考，尽管仍需实验验证。
引言
我们之前的论文介绍了正交高压电色谱（OHPEC）及其专用OHPEC平面色谱柱[1]，描述了其设计、工作原理以及用于分离反应后混合物的初步结果。OHPEC是在其前身正交加压平面电色谱（OPPEC）[2][3][4][5][6][7]的基础上发展而来的。该技术将液相色谱和电泳集成到一个分离系统中，两个过程同时且正交地进行。与在色谱板吸附层内进行分离的OPPEC不同，OHPEC在填充有大量吸附剂的平面色谱柱内实现分离。色谱床的尺寸可根据应用需求进行调整，通常厚度在0.5毫米到几毫米之间，长度和宽度在几厘米到几十厘米之间。这种配置解决了依赖传统色谱板的电色谱系统的常见限制，包括压力耐受性有限、需要额外的密封措施以及由于吸附层脆弱和厚度有限而产生的机械约束。
OHPEC中色谱和电泳的正交结合可能有助于复杂混合物的分离。潜在的应用领域包括选定的反应后混合物、生物技术样品和天然产物提取物，特别是在分析物在色谱和/或电泳行为上存在差异的情况下。为了更全面地了解OHPEC的潜在能力，表1从通量、分辨率、溶剂消耗量和适用于复杂混合物分离的角度，对OHPEC与几种实验室常用技术进行了半定量比较。由于OHPEC仍处于开发初期，这种比较反映了其基于真正填充式平面色谱柱的正交分离机制的潜力，而非已验证的制备技术的实际性能。因此，进一步开发OHPEC是合理的，本研究是提高其实际制备性能的又一步。
尽管OHPEC旨在克服上述限制，但其早期实施过程中出现了一些新挑战。特别是电极室的操作存在问题。在水-有机体系中结合电泳和色谱会导致水电解，从而在电极室内积聚气体。这会减少有效电极表面积，增加电阻，并增加电弧风险，可能损坏平面色谱柱。此外，气泡会干扰检测，流动相中的pH变化会影响带电物质的迁移。因此，定期冲洗电极室对于保持系统稳定性和可重复的分离条件至关重要。与高压操作相关的另一个挑战是焦耳热，它会在色谱床内产生温度梯度，影响局部粘度和扩散，如果过度，会影响分离的重复性。这些现象在基于电迁移的技术中很常见，包括平面电色谱。在加压平面电色谱（PPEC）[8][9][10]和高性能层电色谱（HPLEC）[12][13][14]中，通过在高体积电极室内控制气体积聚来解决问题。在PPEC中，可以通过泵送流动相通过电极室或手动更换溶液来主动冲洗。在HPLEC中，部分流动相流量被持续分流用于电极室冲洗。在这两种系统中，电场沿流动相方向施加，使冲洗与分离同时进行。相比之下，OHPEC的电场垂直于流动方向，这使得冲洗变得复杂。在原始OHPEC设置中，冲洗需要手动干预，既耗时又与自动化工作流程不兼容。与OHPEC类似，PPEC、OPPEC和HPLEC系统通常都采用主动冷却分离单元的方式，有助于减轻焦耳热，但可能无法完全消除高压条件下的温度梯度。
此外，初步实验表明，干填充的OHPEC平面色谱柱的效率相对较低。虽然对于填充有30 μm颗粒的色谱床来说这是可以预期的，但观察到的效率低于仅根据颗粒大小所预期的效率，表明还有其他因素导致了峰宽的增加。由于通量是制备规模分离的关键考虑因素，提高柱效率（体现在更低的柱高上）对于提高分辨率和加速目标化合物的分离非常重要[15]。尽管文献中描述了过压层色谱（OPLC）、PPEC和OPPEC系统的动力学性能，但这些技术使用的是色谱板而非填充式平面色谱柱。对于这些系统，柱高通常为吸附剂颗粒直径的2到5倍[9][16][17][18]，与HPLC柱的柱高一致[19]。在OPPEC中，柱高约为颗粒直径的8倍[5]。尽管干填充的OHPEC平面色谱柱仍处于开发阶段，但它们为概念验证研究和要求较低的应用提供了一个有价值的平台。尽管缺乏关于填充式平面色谱柱的文献数据，OHPEC原型的效率结果为进一步改进平面色谱柱设计提供了宝贵的参考。
本研究旨在通过改进电极室功能、柱效率和整体操作稳定性来解决我们之前OHPEC平面色谱柱配置中发现的局限性。这些改进的效果从热稳定性和pH稳定性、样品注入性能以及OHPEC技术在制备规模分离中的适用性方面进行了评估。此外，本研究还提供了更全面的实验结果，扩展了我们之前的发现。
化学物质和材料
OHPEC平面色谱柱填充了平均粒径为30 μm的C18型吸附剂（POLYGOPREP 60–30 C18，Macherey-Nagel，德国杜伦）。填充的色谱床长度为120毫米，宽度为100毫米，厚度为2毫米。甲醇（MeOH）来自POCh（格利维采，波兰），高纯度水通过HLP脱矿系统生产（Hydrolab，格但斯克，波兰）。柠檬酸-磷酸盐缓冲液通过混合0.1 M柠檬酸和0.2 M磷酸盐制备。
OHPEC平面色谱柱的动力学效率和流动特性
作为本研究的起点，首先确定了OHPEC平面色谱柱的动力学效率（以柱高表示），并与之前使用的色谱柱A进行了比较。在我们之前的工作中[1]，吸附剂是在分离单元内干填充的。该研究的结果基于这种填充方法。
在本研究中，我们尝试了另一种新的方法，使用了第二个色谱柱。
结论
本研究展示了OHPEC平面色谱柱及其仪器的最新进展。重新设计的电极室配备了冲洗和脱气端口，并集成到自动化电路中，显著减少了电极冲洗时间和溶剂使用量，消除了手动干预，提高了热稳定性和pH稳定性。修订后的填充工艺将柱高降低到大约为吸附剂颗粒直径的三倍，证实了
CRediT作者贡献声明
Rafa? Gajos：概念构思、方法论、验证、研究、可视化、初稿撰写、审稿与编辑。Tadeusz H. Dzido：审稿与编辑、资金筹集。
支持信息
额外的实验细节、补充表格和图表（PDF格式）。
资助
本研究是“使用正交高压电色谱技术进行连续制备分离的项目”的一部分，由波兰国家研究与发展中心（NCBR）在波兰国家科学中心（NC）和NCBR的联合项目“TANGO 2”（TANGO2/341314/NCBR/2017）的支持下进行。该研究还获得了
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Rafa? Gajos：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、方法论、研究、概念构思。Tadeusz H. Dzido：审稿与编辑、资金筹集。
