开发并验证了一种用于分析血浆中总抗坏血酸含量的LC-MS/MS方法

《Journal of Chromatography B》：Development and validation of an LC-MS/MS method for the analysis of total ascorbic acid capacity in plasma

维生素C检测方法，LC-MS/MS血浆分析，维生素缺乏症筛查，性别差异，临床营养干预

　　

Dylan S. Kelly | Claude P. van der Ley | Ron Booij | Ido P. Kema | Michel J. Vos | Martijn van Faassen

格罗宁根大学医学中心实验室医学系，荷兰格罗宁根

摘要

开发并验证了一种用于定量血浆中总抗坏血酸（维生素C）的稳健且快速的LC-MS/MS方法。抗坏血酸对抗氧化防御和酶促过程至关重要。在某些患者群体中，抗坏血酸缺乏和维生素缺乏症仍然普遍存在，这可能导致临床症状被忽视或误判。为了在静脉穿刺后保持抗坏血酸的稳定性，EDTA血液样本被置于冰上并在两小时内进行处理。使用三(2-羧乙基)膦（TCEP）将脱氢抗坏血酸还原为抗坏血酸。抗坏血酸通过反相色谱法分离，并通过负离子模式下的串联质谱法检测。方法验证遵循标准协议。对547份患者样本进行了回顾性分析，以评估维生素C缺乏和维生素缺乏症的发生率。15 mM的TCEP浓度足够使用。抗坏血酸在1.08分钟时洗脱，总运行时间为4.6分钟。内部和批次间不精确度（三种浓度）分别为1.8%至2.2%和3.2%至5.7%。定量限为1.1 μmol/L，适用于检测缺乏（<11.4 μmol/L）。在测试的患者中，10%存在抗坏血酸缺乏，20%患有维生素缺乏症。无论年龄如何，男性的维生素C水平比女性低约11 μmol/L。这种经过验证的LC-MS/MS方法能够准确评估临床环境中的总抗坏血酸含量。由于大量患者维生素C水平不理想，因此需要提高意识，以支持有针对性的筛查和营养干预。

引言

抗坏血酸（维生素C）是人体生理中必需的营养素，这是因为人体自身无法合成这种物质。抗坏血酸是一种重要的抗氧化剂[1]，[2]，并且是许多酶促反应的辅因子，例如胶原蛋白、l-肉碱和神经递质（如多巴胺、去甲肾上腺素）的生物合成[3]，[4]。长期缺乏抗坏血酸会导致坏血病[2]。如今，在工业化国家中，坏血病的发病率非常低[5]。全球推荐的抗坏血酸每日摄入量（RDI）在40至110 mg之间[6]。这种推荐的摄入量应使血浆中的抗坏血酸浓度达到约50 μmol/L，这被欧洲食品安全局认为是合适的[7]。血浆中的抗坏血酸浓度受多种人口统计和生活方式因素的影响，如性别、年龄、种族、社会经济地位、妊娠、哺乳、体重/BMI和吸烟[6]。最近的研究表明，在低收入和中等收入国家，维生素缺乏症（定义为抗坏血酸≤23 μmol/L）和抗坏血酸缺乏（定义为抗坏血酸≤11.4 μmol/L）很常见，但在高收入国家也不少见[5]，[8]。某些医院群体面临维生素C缺乏或维生素缺乏症的风险，例如精神病患者、肾移植受者、患有败血症休克或急性呼吸系统疾病的危重患者[9]，[10]，[11]，[12]，[13]。最近的病例报告表明，抗坏血酸缺乏可能会模仿其他疾病，常常导致诊断延迟和医院资源的浪费[14]，[15]，[16]，[17]。充足的抗坏血酸状态对长期健康有益[18]。

显然需要一种简单、稳健且准确的抗坏血酸分析方法。已经发表了多种基于液相色谱（HPLC）结合电化学、紫外（UV）或荧光检测的抗坏血酸分析方法[19]，[20]，[21]，[22]。还有两种方法使用液相色谱结合串联质谱（LC-MS/MS）来确定血浆或血液中的抗坏血酸[23]，[24]。然而，第一种方法仅测量抗坏血酸，而不是总的可利用抗坏血酸含量。在临床化学中，通常会分析抗坏血酸（还原型）和脱氢抗坏血酸（氧化型）的浓度。大多数细胞类型能够有效地将脱氢抗坏血酸再循环为抗坏血酸，因此分析脱氢抗坏血酸和抗坏血酸的总浓度在临床上具有重要意义[25]。在用于分析总可用抗坏血酸含量的方法中，通常会在样品制备过程中添加还原或氧化步骤[26]。第二种方法可以同时测量抗坏血酸和脱氢抗坏血酸，但它们使用的是不易获得的改良电喷雾源，并且处理后的脱氢抗坏血酸稳定性有限（< 4.5小时）。还有其他LC-MS/MS方法用于分析食品中的抗坏血酸，但这些方法缺乏使用适当的稳定同位素标记标准品[27]，[28]。还有一种LC-MS方法使用飞行时间质谱法分析血浆中的抗坏血酸，但这种仪器在临床实验室中不易获得，且比三重四极杆仪器更昂贵[29]。

在这项研究中，我们专注于开发并验证一种简单、快速且稳健的LC-MS/MS测定方法，用于测定人体血浆中的总抗坏血酸含量，适用于临床实验室。我们回顾性地分析了我们在两年期间分析的患者样本中维生素C缺乏和维生素缺乏症的患病率。

试剂

l-抗坏血酸（99.3% ± 0.4%，认证参考物质，TraceCERT）标准品来自Merck（德国达姆施塔特）。¹³C₆-l-抗坏血酸、三氯乙酸（TCA）、乙酸和三(2-羧乙基)膦（TCEP）也来自Merck（德国达姆施塔特）。超高效液相色谱（UPLC）级甲醇（MeOH）、乙腈（ACN）、异丙醇（IPA）和甲酸（FA）购自Biosolve（荷兰瓦尔肯斯瓦德）。UPLC级Millipore水也来自同一公司。

测定性能

该方法的总运行时间为4.6分钟。如图1所示，抗坏血酸在1.05分钟时洗脱。

TCEP优化

对于加标和未加标的样本，响应比率在10至20 mM TCEP之间达到最大值（图2）。计算了加标脱氢抗坏血酸的回收百分比。即使使用低至5 mM的TCEP浓度，也始终发现回收率≥100%（表1）。对于其余实验，选择15 mM TCEP浓度为最佳浓度。

讨论

本研究展示了一种用于定量血浆中总抗坏血酸含量的LC-MS/MS方法的开发和验证。该方法确保了样品制备的稳健性和简便性，从而实现了一种快速且易于操作的LC-MS/MS方法。使用TCEP结合稳定的同位素标记内标确保了分析的稳健性，成功校正了任何损失或信号抑制现象。

TCEP的使用不仅将脱氢抗坏血酸还原为抗坏血酸……

作者声明

所有作者均充分了解了对手稿所做的所有修订和修改。所有作者都审查了这些变更，并批准提交该手稿。

CRediT作者贡献声明

Dylan S. Kelly：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，验证，监督，方法学，研究，数据分析。Claude P. van der Ley：撰写 – 审稿与编辑。Ron Booij：撰写 – 审稿与编辑，数据管理。Ido P. Kema：撰写 – 审稿与编辑。Michel J. Vos：撰写 – 审稿与编辑。Martijn van Faassen：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，监督，数据管理。

未引用的参考文献

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利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。