《Journal of Chromatography B》：Trinity synergy of guanidine-functionalized polymer brush-modified β-cyclodextrin polymer magnetic beads for recognition of phosphopeptides in serum of Alzheimer's disease
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高效磁性吸附剂magCEP@PEI@G通过β-CD-epichlorohydrin聚合物、PEI和胍基团协同作用，实现磷酸肽的高选择性富集，检测限低至0.2 fmol，在AD患者血清中成功鉴定135个磷酸肽，为早期诊断提供新工具。
梅阳|赵元志|陈守林|刘春波|严英华|田海华
中国浙江省宁波市宁波大学附属康宁医院（Ningbo Kangning Hospital）药物成瘾与脑健康浙江省重点实验室精神病学系
摘要
系统地分析蛋白质磷酸化对于阐明阿尔茨海默病（AD）的分子发病机制至关重要。本文报道了一种多功能磁性吸附剂magCEP@PEI@G的合理设计，该吸附剂结合了β-环糊精-环氧氯丙烷聚合物、聚乙烯亚胺（PEI）和胍基功能团，以实现协同富集磷酸肽。这种混合材料表现出前所未有的性能：可重复使用10次，富集效率仍保持95%以上；检测限极低（0.2 fmol）；选择性极高（磷酸肽与非磷酸肽比例为5000:1）；洗脱速度快（10分钟）；回收率接近完美（105.0 ± 0.5%）。将magCEP@PEI@G应用于三名AD患者的血清样本后，成功鉴定出135种独特的磷酸肽。这些结果表明，magCEP@PEI@G是一种高效且可扩展的平台，适用于低丰度磷酸肽的敏感富集，对阿尔茨海默病的早期诊断具有重大潜力。
引言
蛋白质磷酸化是一种高度动态且可逆的翻译后修饰，它在调节基本生物过程（如细胞信号传导、代谢流和细胞周期进展）中起着核心作用[1]、[2]、[3]。这种平衡受到激酶（催化磷酸基团添加）和磷酸酶（介导其去除）的相互作用严格控制，从而精细调节细胞反应和功能状态[4]、[5]。研究表明，磷酸化不仅影响蛋白质的结构和功能[6]、[7]，还对蛋白质-蛋白质相互作用和细胞定位至关重要[6]、[7]。因此，阐明磷酸化对蛋白质功能的具体影响对于理解信号通路及其在疾病发展中的作用至关重要。磷酸肽在其序列中包含一个或多个磷酸化氨基酸残基，对于研究蛋白质的生物功能及相关疾病至关重要[8]、[9]。然而，由于在血清、细胞提取物和组织匀浆等复杂生物样本中磷酸肽的丰度较低，且不同磷酸肽的化学性质各异，其在质谱分析中的分离和富集仍然是一个重大挑战[10]、[11]。在这种背景下，开发新型富集材料和策略成为该领域的重要课题[12]、[13]、[14]。
β-环糊精（β-CD）是一种生物相容性的环状寡糖，由七个葡萄糖单元组成，具有独特的客体-主体结构：其外表面富含羟基，赋予其强烈的亲水性，使其在糖肽富集方面具有显著优势[15]。近年来，β-环糊精-环氧氯丙烷聚合物（β-CEP）因出色的吸附能力和选择性而在药物输送、废水净化和污染物去除方面得到广泛应用[16]、[17]。β-CEP有望克服传统磷酸肽富集材料的局限性，后者通常由于亲水基团不足和活性位点密度低而影响特异性和选择性。作为聚合物，PEI提供了大量可供胍基修饰的活性位点，其众多的氨基还可以提高材料的亲水性。此外，PEI的氨基带有正电荷，在广泛的pH范围内易于质子化，从而可以通过静电作用选择性富集磷酸肽[18]、[19]。胍基具有很强的捕获磷酸肽的能力，但相关研究较少[20]、[21]。因此，开发一种胍基修饰的β-CEP改性材料是一个新的尝试。
受此启发，本文采用涂有β-环糊精-环氧氯丙烷聚合物的磁性球体，并进一步引入PEI和胍基进行功能化，这种新材料在磷酸肽富集方面具有显著优势。首先，β-环糊精独特的结构特征（疏水腔和亲水外表面）使其能够选择性识别和结合磷酸肽。引入PEI和胍基后，进一步增强了了对磷酸基团的亲和力，提高了富集的选择性。其次，磁性材料在外加磁场下可实现快速分离，简化了富集过程并提高了实验效率。第三，多功能表面修饰提供了丰富的功能基团，可与磷酸肽形成多种相互作用（如氢键、静电相互作用和胍基-磷酸相互作用），从而进一步提高捕获效率。此外，β-CEP的三维网络结构提供了较大的比表面积和孔体积，能够在复杂生物样本中容纳更多磷酸肽的同时保持稳定性。值得注意的是，这是首次将β-CEP应用于磷酸肽富集的研究，为蛋白质组学分析提供了一种新型且高效的工具，具有广泛的应用前景。
试剂
试剂
所有化学试剂均从经过验证的供应商处购买：氢氧化钠、六水合氯化铁、盐酸和丙酮购自Sinopharm Chemical Reagent（中国）；乙二醇和乙腈购自Aladdin（中国）；四氢呋喃、N,N'-羰基二亚胺（CDI）、乙醇、聚乙烯亚胺（PEI）、环氧氯丙烷和乙酸钠购自Macklin（中国）；β-酪蛋白、N,N-二甲甲酰胺（DMF）、甲醛溶液（37%）、三乙胺和牛血清
magCEP@PEI@G的合成与表征
magCEP@PEI@G的合成过程如图1所示。首先制备涂有β-CEP的磁性珠子。β-环糊精的独特结构使其能够通过疏水腔和亲水外表面选择性包封磷酸肽。β-CEP上的丰富羟基为PEI提供了大量的修饰位点。随后，在β-CEP改性的磁性珠子表面引入PEI和胍基
结论
总体而言，本研究开发了一种胍基修饰的磁性纳米材料magCEP@PEI@G，首次将β-环糊精磷酸酯（β-CEP）结合进来，实现了对磷酸肽的高选择性富集。通过β-CEP的疏水包封、聚乙烯亚胺（PEI）的静电吸引以及胍基与磷酸基团之间的特异性双齿氢键作用，该材料实现了高效富集
CRediT作者贡献声明
梅阳：撰写初稿、方法学设计、实验研究。赵元志：撰写初稿、方法学设计、数据管理。陈守林：数据分析、概念构思。刘春波：结果验证、数据分析。严英华：撰写、审稿与编辑、监督、概念构思。田海华：撰写、审稿与编辑、监督、资金申请。
伦理批准
正常对照组和AD患者的血清样本由宁波大学附属康宁医院提供，已获得该医院伦理委员会的批准（NBKNYY-2021-LC-40）。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了宁波市医学科技项目（2025Y16）、浙江省医疗卫生科学计划（2025HY1036）、宁波市自然科学基金（2025J190, 2022S072）、宁波市医疗卫生品牌学科（PPXK2024-07）以及宁波市顶尖医疗卫生研究计划（2022030410）的支持。
