使用单一替代肽，通过两种亲和捕获液相色谱-质谱（LC-MS/MS）方法对大鼠体内新型ADC的总抗体和结合抗体进行定量分析

《Journal of Chromatography B》：Quantification of total and conjugated antibody of a novel ADC in rat by two affinity-capture LC-MS/MS methods using a single surrogate peptide

本研究开发了两种亲和捕获LC-MS/MS方法用于量化GL-2401在Rat血清中的总抗体和偶联抗体，验证了其准确性和精密度（0.50-100.00 μg/mL和0.50-40.00 μg/mL），并通过药代动力学研究证实其相比传统ADC更高的血清和连接子稳定性。

　　

尹萍萍|刘婷婷|陶一敏|洪金川|秦秋萍|龚立坤

南京中医药大学，中国南京 210023

摘要

GL-2401是一种新型的抗体药物偶联物（ADC），通过将单甲基奥瑞斯塔汀E（MMAE）与曲妥珠单抗的N297糖基化位点进行位点特异性酶促偶联制备而成。本研究旨在开发两种可靠的生物分析方法，用于定量大鼠血清中的总抗体（TAb）和GL-2401的偶联抗体，以探讨其药代动力学（PK）特征。我们开发了两种亲和捕获LC-MS/MS方法，一种用于测定偶联抗体，另一种用于测定总抗体。在两种方法中，首先使用固定在链霉亲和素磁珠上的生物素化捕获试剂富集大鼠血清中的目标分析物，然后进行洗涤和珠上胰蛋白酶消化。随后，利用来自曲妥珠单抗互补决定区2（CDR2）的特征肽IYPTNGYTR作为单一替代分析物，来定量偶联抗体和总抗体。经验证，这两种方法在0.50–100.00 μg/mL和0.50–40.00 μg/mL的范围内具有良好的准确性和精确度。最后，将验证后的方法应用于大鼠药代动力学研究，结果表明GL-2401在血清和连接子方面的稳定性优于传统的ADC。

引言

抗体药物偶联物（ADC）是由单克隆抗体、连接子和细胞毒性小分子药物组成的靶向抗癌治疗剂[1]，[2]。其作用机制主要涉及单克隆抗体与目标抗原结合，随后通过内吞作用进入肿瘤细胞，在溶酶体中连接子断裂释放细胞毒性载荷，最终通过干扰有丝分裂或DNA损伤杀死肿瘤细胞[3]。与传统化疗药物相比，作为新型抗癌剂，ADC具有更少的副作用、更高的特异性、更好的治疗效果和更可控的剂量。ADC的概念可以追溯到1913年，当时“化疗之父”保罗·埃利希首次提出了“魔术子弹”假说[4]。然而，由于早期技术限制，如显著的脱靶毒性、不成熟的抗体药物偶联技术和细胞毒性药物效力不足，ADC的发展长期停滞[5]，[6]，[7]。直到20世纪末，ADC的发展才进入快速进步阶段，这得益于三项关键技术突破：单克隆抗体技术的革命性进展、高效细胞毒性药物的发现和优化，以及新型连接子和位点特异性偶联技术的创新[8]，[9]，[10]。特别是近年来，ADC药物已成为靶向癌症治疗的关键策略之一，这得益于抗体工程、生物偶联化学和药代动力学优化的多学科进展[11]，[12]。2021年，中国的首个自主研发ADC药物Aidixi获得了国家药品监督管理局（NMPA）的批准[13]。截至2025年，全球ADC开发势头强劲，正在进行超过1300项相关临床试验，已有15种ADC药物获得FDA批准[14]。

ADC的制造采用两种主要偶联策略：随机偶联和位点特异性偶联。随机偶联策略主要用于早期ADC药物的开发，产生多种异质混合物[15]。赖氨酸偶联是一种成熟的随机偶联技术，利用赖氨酸残基上大约40个可被溶剂接触的NH2基团（在中性溶液中具有高亲核性），亲电试剂主要针对这些氨基团，使连接子-载荷能够附着而不改变抗体本身[16]。在随机链间半胱氨酸偶联中，IgG抗体的四个链间二硫键部分或完全还原，生成多达八个自由巯基。这些巯基作为强亲核试剂，容易与马来酰亚胺基连接子发生迈克尔加成反应。该反应效率很高，可产生每个抗体含有0、2、4、6或8个药物载荷的ADC变体[17]，[18]。位点特异性偶联策略通过基因工程、代谢标记物或化学酶反应修饰单克隆抗体，引入偶联位点，从而实现与小分子药物的位点特异性结合[19]。迄今为止已开发出多种位点特异性偶联技术，包括引入工程化活性半胱氨酸残基、非天然氨基酸、糖基化、二硫键重联、酶促偶联和pClick技术[20]。

GL-2401是一种新型的位点特异性偶联ADC，药物与抗体的比例（DAR）为2，分子量为149,006 Da（图1）。GL-2402、GL-2403和GL-2404是通过经典链间二硫键还原的半胱氨酸偶联生成的，其DAR分别为2、4和6。它们由中国科学院上海药物研究所黄伟教授的研究团队开发，用于乳腺癌治疗。黄伟团队开创了一种新的偶联策略，利用截短的糖链连接子N-乙酰乳糖胺和内切糖苷酶Endo-S2的协同作用，一步将微管抑制剂MMAE高效且位点特异性地偶联到曲妥珠单抗重链Fc区域的N297糖基化残基上，显著提高了偶联效率和位点特异性，并为ADC的构建提供了更简化、更可控的途径[21]。由于GL-2401的偶联位点位于抗原结合区域的远端，因此保持了良好的抗体结合特异性，同时提高了结合效率和结构稳定性。

传统的ADC和总抗体（TAb）分析平台主要依赖于配体结合测定（LBA），该方法具有足够的灵敏度、良好的精确度和高样本通量。然而，这类测定方法存在一些局限性，包括对专用试剂的依赖性、潜在的低特异性、交叉反应性和对基质干扰的敏感性[22]，[23]。过去十年中，LC-MS/MS作为一种新的分析方法出现，可用于定量ADC和总抗体，实现基于仪器的精确数值测量。该方法利用大分子蛋白质的替代肽作为目标分析物，无需专用试剂。LC-MS/MS技术具有高特异性、强抗干扰性、低试剂需求和对基质效应的低敏感性，有效弥补了LBA在生物大分子定量方面的局限性[24]，[25]，[26]。

在本研究中，我们建立了两种亲和捕获LC-MS/MS方法，分别用于定量大鼠血清中GL-2401的偶联抗体和总抗体浓度。验证后的方法进一步应用于体内药代动力学（PK）研究，比较了GL-2401与随机偶联ADC GL-2402的代谢特征，两者具有相同的DAR值但偶联方式不同。同时，还进行了不同DAR值的随机偶联ADC（GL-2402、GL-2403、GL-2404）的多次给药实验，以研究不同DAR值对随机偶联ADC代谢的影响。结果确定了与清除率和系统暴露相关的关键PK参数，揭示了不同偶联策略ADC在代谢稳定性和消除动力学方面的显著差异。这些发现强调了偶联方法对ADC药代动力学的重要影响，为优化其设计和治疗效果提供了宝贵见解。

化学物质和试剂

GL-2401（储备浓度18.2 mg/mL）、GL-2402（储备浓度11.6 mg/mL）、GL-2403（储备浓度20 mg/mL）、GL-2404（储备浓度18.4 mg/mL）由中国科学院上海药物研究所黄伟教授提供。抗MMAE抗体购自Biointron Biological Inc.（上海，中国）。重组人HER2购自上海济南科技有限公司（苏州，中国）。肽IYPTNGYTR（纯度）

替代肽的选择

GL-2401使用曲妥珠单抗作为抗体成分。在选择替代肽时，我们对抗体进行了生物信息学分析。使用序列比对工具预测了曲妥珠单抗重链Fab片段中CDR2的氨基酸序列。随后通过Expasy蛋白质组学平台对预测的CDR序列进行了胰蛋白酶消化模拟，系统评估潜在的肽特性（表1）。以确保特异性

结论

我们开发了两种亲和捕获LC-MS/MS方法，用于准确定量GL-2401的偶联抗体和总抗体。每种方法每个样本仅需25 μL的大鼠血清。两种分析物均经过亲和捕获、变性、还原、烷基化和消化处理，随后进行LC-MS/MS分析。每种方法的整个仪器分析仅需7分钟。此外，两种方法使用相同的替代肽进行定量，显著提高了效率

CRediT作者贡献声明

尹萍萍：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、验证、软件、方法学、研究、正式分析。刘婷婷：撰写 – 审稿与编辑、可视化、验证、软件、方法学、研究、正式分析。陶一敏：验证、方法学。洪金川：验证、方法学。秦秋萍：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、监督、方法学、研究、数据整理、概念化。龚立坤

机构审查委员会声明

GL-2401、GL-2402、GL-2403和GL-2404的动物研究方案已获得中国科学院上海药物研究所的机构审查委员会（或伦理委员会）的批准（IACUC编号2025–05-GLK-100，有效期至2025年5月）。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。